植酸酶在米糠谷蛋白提取中应用的研究

马永强,程文红,那治国,王　鑫

(哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076)



植酸酶在米糠谷蛋白提取中应用的研究

马永强,程文红,那治国,王鑫

(哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076)

以脱脂米糠分级去除清、球、醇溶蛋白后的残渣为原料,以植酸去除率为评价指标,以酶解温度、酶解pH、酶解时间和植酸酶添加量为影响因素进行单因素实验。在此基础上,根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理,设计三因素三水平响应面优化实验。在分析各个因素的显著性和交互作用后,得出去除植酸的最佳工艺条件为:植酸酶添加量2.5 U/g,pH5.6,酶解温度48 ℃,酶解时间3 h,此条件下,模型实际值为85.47%。在最优植酸酶解条件下,米糠谷蛋白的提取率和纯度分别提高了24.53%和10.16%,与此同时,谷蛋白中植酸含量降低了93.2%,溶解性也一定程度上得到了改善。

谷蛋白,植酸酶,植酸去除率,提取率

米糠蛋白是世界公认的优质植物性蛋白,占米糠总质量的12%～20%[1]。多年研究表明,米糠蛋白是一种低过敏性蛋白,其氨基酸组成接近FAO/WHO的推荐模式,是一种极具开发潜力的新型植物蛋白[2]。此外,米糠蛋白已被报道具有抗氧化和抗癌特性[3]。米糠蛋白是一种复合蛋白,主要由清蛋白(约37%)、球蛋白(约36%)、醇溶蛋白(约5%)及谷蛋白(约22%)构成,其中约70%为可溶性蛋白质,谷蛋白是主要不溶性蛋白[4]。谷蛋白含有丰富的谷氨酰胺结构,具有较好的弹性,影响烘焙产品的品质,是一种优质蛋白质[5]。但因与植酸等物质结合,使其提取率较低,限制了其在食品加工中的应用。目前认为造成米糠谷蛋白难溶的原因包括分子间二硫键的交联及与植酸及其盐类结合引起结构改变,导致形成不溶性的植酸——蛋白质复合体[6]。Adebiyi研究表明米糠谷蛋白中植酸含量较高,使得谷蛋白不易酶解[7]。植酸,学名肌醇六磷酸酯,其分子式为C6H18O24P6,相对分子质量为660.08,与蛋白分子具有很强的螯合能力,会与蛋白结合形成二元或三元不溶复合物,导致蛋白及氨基酸的消化利用率下降[8]。1980年,Cheryan研究发现,植酸酶水解植酸的磷酸盐残基,有利于增加蛋白的溶解性和提高蛋白的纯度。

植酸酶能催化水解植酸向正磷酸盐及其他磷酸肌醇中间产物转化,释放出磷酸根离子,将与植酸络合的蛋白质释放出来,而不影响蛋白整体结构[9]。在米糠谷蛋白提取前利用植酸酶降解植酸,提高谷蛋白提取率的同时可制备低植酸含量的谷蛋白,还能一定程度上改善谷蛋白的溶解特性。本实验采用Osborne分级提取法去除清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白,通过响应面实验优化植酸酶解工艺,并比较分析了植酸酶解前后谷蛋白提取率及溶解特性的变化,以期为米糠谷蛋白的深加工及应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

米糠实验室磨制;植酸酶酶活力≥3 U/mg;植酸钠(C6H6O2P4Na12)纯度95%;D201大孔阴离子交换树脂上海华羚树脂有限公司;正己烷、钼酸铵、偏钒酸铵、氢氧化钠、氯化钠、无水硫酸钠、盐酸、三氯化铁、磺基水杨酸、福林酚试剂分析纯;植酸钠标准品纯度98%;牛血清白蛋白标准品。

精米机浙东粮检仪器厂;粉碎机天津市泰斯特仪器有限公司;UV-2100紫外可见分光光度计尤尼柯仪器有限公司;离子交换柱(0.8 cm×10 cm);HL-2恒流泵上海泸西分析仪器厂;分析天平上海光正医疗仪器有限公司;电子天平上海越平科学仪器有限公司;磁力搅拌器上海县曹行无线电元件厂;PP-25E型酸度计;低速离心机上海安亭科学仪器厂;电热鼓风干燥箱上海一恒科学仪器有限公司;FD-1C-50型冻干机。

1.2实验方法

1.2.1样品前处理

1.2.1.1脱脂原料米糠粉碎过60目筛,常温下按料液比1∶5加入正己烷,脱脂2 h后4000 r/min离心10 min,将沉淀置于通风橱中自然晾干,即得脱脂米糠。

1.2.1.2酶解脱脂米糠过80目筛,按料液比1∶8加入缓冲液,α-淀粉酶添加量为20 U/g,HCl调节溶液pH6.2,62 ℃水浴2 h,接着调节溶液pH5.0,添加纤维素酶300 U/g,50 ℃水浴2 h[10],90 ℃灭酶15 min,4000 r/min离心15 min,去除上清液,沉淀45 ℃烘12 h得到经α-淀粉酶、纤维素酶酶解的米糠。

1.2.1.3去除杂蛋白参照Osborne法,略作改动。经α-淀粉酶、纤维素酶酶解的米糠加入8倍体积的3% NaCI,45 ℃恒温水浴1.5 h,重复两次操作去除清蛋白、球蛋白;继续加入8倍体积的70%乙醇,45 ℃恒温水浴1.5 h,重复两次操作去除醇溶蛋白,残渣45 ℃烘12 h,得到去除杂蛋白后的米糠原料[11]。

1.2.2植酸酶的活化及酶活力测定

1.2.2.1酶的活化称取2.00 g植酸酶,pH为5.4的乙酸缓冲液将其定容到1000 mL,超声波溶解器上超声溶解10 min,功率设定为500 W,再用磁力搅拌器中速搅拌20 min,使酶活化,使用前存放在4 ℃冰箱中[12]。

1.2.2.2酶活力测定参照GB/T 18634-2009 饲用植酸酶活性的测定[13]。经测定,实验所用植酸酶活为2.49 U/mg。

1.2.3影响植酸去除率的单因素实验分4组(每组准确称取去除杂蛋白后的米糠原料5.000 g)进行实验。第一组:在不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)条件下,酶添加量为2.0 U/g,温度55 ℃,恒温酶解2.5 h;第二组:调节pH5.5,酶添加量为2.0 U/g,在不同温度(35、40、45、50、55、60、65 ℃)条件下恒温酶解2.5 h;第三组:调节pH5.5,温度为55 ℃,植酸酶添加量分别为(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 U/g),酶解2.5 h;第四组:调节pH5.5,酶的添加量为2.0 U/g,温度为55 ℃时分别酶解(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)进行酶解。实验用3%的TCA灭活酶以控制酶解时间,用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH溶液控制反应溶液的pH。分别测定各组试样酶解后的植酸含量,三次平行,取平均值。

1.2.4响应曲面法实验设计在单因素实验基础上,根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理选取对植酸去除率影响显著的pH、温度、时间三因素,设计实验。因素与水平见表1。

表1　因素与水平表

1.2.5植酸含量的测定参照GB/T 5009.153-2003 植物性食品中植酸含量的测定,略有改动。本实验用D201大孔阴离子交换树脂代替国标中使用的AG1-X4阴离子交换树脂[14-15]。实验得到植酸含量工作曲线方程为y=-1.1683x+0.9012,相关系数R2=0.9957。

1.2.6米糠谷蛋白提取及测定方法

1.2.6.1植酸酶解方法准确称取去除杂蛋白后的米糠原料5.000 g溶于50 mL pH为5.6的缓冲液中,植酸酶添加量2.5 U/g,48 ℃水浴加热3 h,4000 r/min离心15 min,倒去上清液,残渣水洗两次后进行谷蛋白提取实验。

1.2.6.2谷蛋白提取残渣2按料液比1∶8加入0.02 mol/L NaOH溶液,调节pH为9,45 ℃恒温水浴1.5 h,4000 r/min离心15 min取上清液(重复两次操作),测得蛋白含量,得出谷蛋白提取率[16]。上清液pH调至4.8,静置0.5 h,4000 r/min离心15 min,沉淀水洗,pH回调至7.0,冷冻干燥,得米糠谷蛋白。

1.2.6.3谷蛋白含量测定米糠中蛋白含量测定采用凯氏定氮法,参照GB 5009.5-2010,蛋白质系数为5.95[17]。上清液中蛋白质含量测定采用福林酚法[18]。实验得到蛋白含量标准曲线方程为y=0.0011x+0.0073,相关系数R2=0.9956。

1.2.6.4蛋白含量测定指标

米糠谷蛋白提取率(%)=提取液中谷蛋白质量/样品中总谷蛋白质量×100

蛋白质纯度(%)=冷冻干燥后浓缩蛋白样品中蛋白质含量/冷冻干燥后浓缩蛋白样品重×100

1.2.6.5米糠谷蛋白溶解度的测定分别称取0.1 g植酸酶处理前后碱提得到的米糠谷蛋白样品,加入20 mL蒸馏水,将pH分别调至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11,25 ℃下磁力搅拌1 h,4000 r/min转速下离心15 min,收集上清液,测其蛋白含量。计算公式如下:

1.2.7数据统计所得数据均为三次重复的平均值,数据统计分析采用SPSS13.0进行方差分析,响应面所得数据使用Design-Expert.V8.0.6软件进行数据分析。

2　结果与讨论

2.1去除植酸的单因素实验结果

2.1.1酶解pH对植酸去除率的影响图1表明,pH对植酸酶解效果影响较大。在pH3.5～5.5范围内随着pH的增加植酸去除率上升,且上升趋势增大;在pH5.5左右时植酸去除率达到最大为72.38%,酶活最高;pH5.5～6.5范围内,植酸去除率随pH的增大明显减小。植酸酶的最适pH约为5.5,符合植物性植酸酶的最适pH4～6。植酸酶对pH很敏感,因此应将pH范围控制在5～6之间。

图1　酶解pH对植酸去除率的影响Fig.1　Effect of enzymolysis pH on phytic acid removal rate

2.1.2酶解温度对植酸去除率的影响图2表明,温度在35～65 ℃间,植酸去除率随温度的增加而呈现先缓慢上升后显著下降的趋势。在温度为50 ℃时,植酸的去除率达到最大值83.30%,符合植物性植酸酶的最适温度45～60 ℃。实验应将反应温度控制在45～55 ℃之间。

图2　酶解温度对植酸去除率的影响Fig.2　Effect of enzymolysis temperature on phytic acid removal rate

2.1.3酶添加量对植酸去除率的影响图3表明,植酸含量在酶添加量为0.5～3.5范围内变化不大,当酶添加量达到2.0 U/g,随着酶添加量的增加,相应的植酸含量趋于平衡,表明植酸酶只能在一定程度上促进植酸盐的酶解。因此,实验确定酶添加量为2.5 U/g。

图3　酶添加量对植酸去除率的影响Fig.3　Effect of enzyme addition on phytic acid removal rate

2.1.4反应时间对植酸去除率的影响图4表明,随着反应时间的延长,1.0～2.5 h之间逐渐上升,在2.5 h之后有轻微上升趋势,但是趋于平缓。在2.5～3.5 h之间均能较好的去除植酸效果。因此,反应时间选择在2.5～3.5 h间。

图4　反应时间对植酸去除率的影响Fig.4　Effect of enzymolysis time on phytic acid removal rate

2.2响应面实验结果与分析

表2　响应面分析方案与实验结果

表3　回归模型方差分析

2.2.2响应面分析与优化椭圆图形的中心区域,植酸去除率最高,椭圆排列越密集,说明因素变化对植酸去除率影响较大。结果显示,模型中一次项A(p<0.0001)、B(p<0.0001)及C(p=0.0042<0.01)影响极显著,三者的二次项对植酸去除率的曲面效应极显著,AB、AC的p<0.01,说明因素间有极显著的交互作用,BC的p>0.05,表明反应温度和时间没有显著地交互作用。交互显著项对米糠中植酸去除率影响的响应曲面如图5、图6所示。

图5　pH与温度交互作用的三维曲面图Fig.5　Response surface and contour plots showing the effects of enzymolysis pH and temperature on phytic acid removal rate

图6　pH与时间的交互作用Fig.6　Response surface and contour plots showing the effects of enzymolysis pH and time on phytic acid removal rate

2.2.3最优条件的确定及验证根据回归模型通过Design Expert软件分析得出最佳工艺参数为:植酸酶添加量2.5 U/g,pH5.64,酶解温度48.39 ℃,酶解时间2.99 h,植酸去除率为86.04%。根据操作的实际情况,将最佳工艺参数调整为:植酸酶添加量2.5 U/g,pH5.6,酶解温度48 ℃,酶解时间3 h。在该条件下重复3次测定的结果显示,米糠中植酸去除率平均为85.47%,与预测值相对误差为0.66%。表明模型与实际实验结果相符,该模型可较好地优化米糠中植酸去除工艺参数。

2.3米糠谷蛋白含量指标比较分析

2.3.1米糠谷蛋白溶解度比较分析植酸酶解前后米糠谷蛋白的溶解性在pH5时较低,原因是米糠谷蛋白等电点为4.7,在等电点附近,水化作用最弱,溶解度最小;米糠谷蛋白含有少量的酸溶性谷蛋白,因此在酸性环境下蛋白溶解度略有提高,谷蛋白在碱性环境下溶解性更好原因可能是谷蛋白分子中的二硫键断裂[19]。植酸酶解后,不同pH环境下谷蛋白溶解度都有不同程度的提高,可能是因为植酸含量大幅度减少,使得更多的谷蛋白从植酸-谷蛋白解聚出来,蛋白紧密的结构变得疏松,从而增加了谷蛋白的溶解性。

图7　植酸酶解前后不同pH米糠谷蛋白溶解性的比较Fig.7　Comparison of solubility of gluten under different pH

2.3.2米糠谷蛋白其他指标比较分析由表4可得,植酸酶解前后谷蛋白提取率和纯度分别提高了24.53%、10.16%。植酸酶降解米糠中的植酸,从而破坏植酸和谷蛋白的螯合作用,解除其对谷蛋白提取的干扰,提高了米糠谷蛋白的溶出率,使得谷蛋白提取率和纯度均有较大提高。同时植酸酶解后谷蛋白植酸含量降低了93.2%,而低植酸蛋白有利于提高蛋白质及氨基酸的利用率[20]。

表4　米糠谷蛋白含量指标比较

3　结论

实验利用Design Expert软件进行实验设计,对米糠中植酸酶解的工艺条件进行了优化,并比较分析了植酸酶解前后谷蛋白提取率及溶解特性的变化,结论如下:植酸酶解的最佳工艺条件为:植酸酶添加量2.5 U/g,pH5.6,酶解温度48 ℃,酶解时间3 h,此条件下,植酸去除率为85.47%。经植酸酶解后,谷蛋白提取率及纯度分别提高了24.53%、10.16%,谷蛋白的溶解性得到了一定程度提高,同时制得低植酸含量谷蛋白,为进一步开发利用米糠谷蛋白提供了理论基础。

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Application of phytase on the extraction of rice bran gluten

MA Yong-qiang,CHENG Wen-hong,NA Zhi-guo,WANG Xin

(College of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Key Laboratory for Food Science and Engineering in Heilongjiang College and University,Harbin 150076,China)

The residue was used as experiment material,after albumin,globulin,prolamin were removed from defatted rice bran. Single factor experiments were conducted to explor effects of four reaction parameters,including temperature,pH,time and phytase addition amount on degradation of phytic acid in rice bran. Based on this,the response surface methodology was designed according to the principle of Box-Benhnken central combination design. The results showed that the optimal conditions were obtained as follows:phytase addition dosage 2.5 U/g,pH5.6,reaction time was 3 h,reaction temperature was 48 ℃. The practical phytic acid removal rate was 85.47%. Under the optimal conditions,the extraction yield and purity of rice bran gluten were increased by 24.53% and 10.16% respectively. At the same time,phytic acid content in gluten was reduced by 93.2% and the solubility of gluten improved to a certain extent.

gluten;phytase;phytic acid removal rate;extraction yield

2015-10-26

马永强(1963-)，男，教授，研究方向：食品酶学与食品化学，E-mail：qyma163@126.com。

黑龙江省科技攻关课题(GC12B403)。

TS209

A

1002-0306(2016)10-0189-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.030