酶解制备鹿血浆活性多肽工艺研究

秦凤贤 贾冬舒 武军 胡铁军 陈巍 庄红

鹿血浆是鹿血经抗凝处理后，利用离心分离技术得到的液体，占全血总量的55%左右。鹿血浆中水分占90%～92%，蛋白质占 6.5%～8.5%，还有约2%的小分子物质。鹿血浆中主要的生物活性物质是鹿血浆蛋白，其主要是由球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原组成。本研究以梅花鹿血液为原料，通过高速离心作用分离出鹿血浆，再利用蛋白酶的催化作用将其水解制备成鹿血浆肽。试验中以水解度为筛选指标，考察了蛋白酶种类、复合酶配比、温度、加酶量、pH、时间、热处理温度、热处理时间对水解度的影响，并运用响应面试验优化方法对试验结果进一步优化，得出最优的酶解工艺参数，且对最优酶解参数下制备的鹿血浆肽的抗氧化能力与酶解前的鹿血浆作了对比。

材料与方法

材料与试剂。鹿血：长春嘉禾鹿业有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶为诺维信天津公司生產；DPPH、ABTS为Sigma公司；檬酸钠，甲基红、溴甲酚绿指示剂，碳酸氢钠 ，氢氧化钠，盐酸，硼酸，无水乙醇，硫酸铜，硫酸钾，浓硫酸，铁氰化钾，三氯乙酸、甲醛等均为北京化工厂。以上试剂均为分析纯。

仪器与设备。电子分析天平、PH计、全自动凯氏定氮仪、高速冷冻离心机、紫外可见分光光度计、磁力搅拌器。

方法。（1）鹿血浆的酶解。取10ml新鲜抗凝鹿血，根据鹿血浆中的蛋白质含量用蒸馏水调节底物浓度，用2mol/l的HCl或NaOH调节，加入一定量的酶，在恒温水浴振荡器中水解一定时间，取出后沸水浴90℃，5min灭菌，冷却至室温，调pH 值至7，4000r/min离心10min，取上清液备用。（2）鹿血浆中蛋白质的测定，参照 GB5009.5-2010方法进行测定。（3）蛋白质水解度的测定。蛋白质水解度DH=样品中总氮/酶解液中游离氨基氮×100%；游离氨基氮的测定采用甲醛滴定法。（4）抗氧化活性测定方法。（5）DPPH自由基清除率的测定。取 25μl样品溶液与0.7ml、0.1 mmol/L DPPH 无水乙醇溶液混匀，避光放置20min，在波长517 nm 下测其吸光值 Ai；同时测其样品对照Aj和空白对照Ac。

DPPH 清除率=

（6）ABTS 自由基清除率的测定。将 7 mmol/L ABTS 溶液与 2.45 mmol K2S2O8溶液按 1：1 混合均匀，避光放置 12-16 h，用磷酸盐缓冲溶液（0.2 M，pH7.4）进行稀释，于 734 nm 波长下吸光度达到 0.70±0.02，为 ABTS 测定液。取 4.0 ml ABTS 测定液，加入 100 μl样品溶液，振荡 30 s，在波长为 734 nm 下测定吸光值（A1），空白管（A0）用磷酸盐缓冲溶液替代样品，对照管（A2）用磷酸盐缓冲溶液代替 ABTS 测定液。

ABTS 自由基清除率=

（7）还原力的测定。在0.5 ml的样品溶液中添加2.5 ml pH 值为 6.6的磷酸盐缓冲溶液和2.5 ml 1%的铁氰化钾溶液，摇匀后，50℃水浴，保温 20 min，再加入 2.5 ml 10%的三氯乙酸，4000 r/min 离心 10 min，取上清 2.5 ml 与 0.5 ml 0.1%的三氯化铁溶液混匀，静置10 min ，在波长 700 nm 下测定吸光值，吸光度值越大，样品还原能力越强。

结果与分析

酶解工艺参数的响应面优化。（1）响应面试验结。在单因素试验的基础上，以酶解温度、加酶量、pH 值为自变量，以水解度为响应值，采用响应面试验设计方法进行三因素三水平优化试验，试验结果如表1 所示。

（2）回归方程的建立和模型评价。利用 RAS软件对影响鹿血浆蛋白酶解的工艺参数进行优化，所得的二次回归方程如下：

式中： X1-温度（℃）；X2-加酶量（%）；X3-pH（%）。

并对回归模型进行方差分析，结果表明模型的P=0.0004<0.01，说明回归方程描述的各自变量与响应值之间关系显著，模型拟合性好。

鹿血浆酶解前后抗氧化能力比较。将在最优酶解工艺条件下制备的鹿血浆酶解液与未水解的鹿血浆进行DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力及还原能力比较，结果如表2 所示。

由上表可知，鹿血浆蛋白经酶解处理成鹿血浆肽之后，其DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和还原能力均有明显提高，说明鹿血浆经酶解反应后，保留并加强了其抗氧化功能。

结论

通过实验确定以中性蛋白酶和风味酶以1：1组成复合酶，酶解梅花鹿血浆原料，其最佳酶解工艺条件为加酶量为5.8%，酶解的温度为45.2℃，pH为7.05，所得酶解液的水解度为18.60%；酶解液的氧化还原性及自由基的清除能力，明显优于酶解前。

基金项目：长春市重大科技攻关计划（鹿血活性多肽微胶囊制备及产业化关键技术，项目编号：14KG070）。

作者简介：秦凤贤（1980-），女，工程师。研究方向为食品科学肉产品；通讯作者简介：武军（1964—），女，副教授，研究方向为食品科学。

（作者单位：秦凤贤 贾冬舒 武 军 胡铁军 陈 巍 长春科技学院生物食品学院；庄 红 吉林大学军需科技学院）