多粘类芽孢杆菌GA1产絮凝剂的培养基和分段培养工艺

赵丹丹

微生物絮凝剂是近年来的一种新型水处理剂，是由产絮凝剂微生物在其生长的过程中素分泌出来的一种天然的高分子物质，其具有较强的清除污渍、褪色的能力，能够应用的范围十分广泛。与传统的无机絮凝剂与高分子合成的絮凝剂，其降解的速度较慢，同时还会释放一定的毒素，容易造成环境的二次污染。但是微生物絮凝剂具有无毒易降解的特点，使用时不会对环境造成二次污染。

就目前而言，关于微生物絮凝剂的相关分析与研究大多都是通过实验来进行验证的，并没有投入到实际的工业化生产阶段。由于微生物絮凝剂的生产成本较好且产量较低，进而其价格较高，在大规模的工业生产中难以推广。听此，降低微生物絮凝剂的生产成本及提高其生产的产量就是微生物絮凝剂近期内发展的方向，也是开展大规模工业化生产的关键。据此，本研究就针对1株产絮凝剂微生物多粘类芽孢杆菌GAI的培养基成分和培养的工艺方面入手，运用分段培养法来进行培养并观察，看其能否有效地提升絮凝剂产量及缩短生产的周期。

多粘类芽孢杆菌GA1产絮凝剂的培养基和分段培养工艺试验

材料与方法。（1）试验菌种：本试验所采用的菌种为实验室中常用的常规细菌分离发从土壤中提取的1株高效产絮 凝剂微生物，其编号为GAI。（2）菌种鉴定：①形态学鉴定，即将菌株GAI使用革兰氏染色和芽孢染色，并通过在显微镜下观察其菌落、菌体的形态所发生的变化。②生理生化鉴定，即对菌株GAI的生理生化指标进行检测，并将其结果与《伯杰细菌分类手册》中的相关标准进行对比与鉴定。③16S r DNA 序列相似性分析鉴定。该鉴定就是将GAI放置到牛肉膏蛋白胨固体培养基中，对其进行24小时的培养，而后再挑取少许的菌落置于500 mL的蒸馏水中，并使用DNA试剂来提取相关性状。（3）种子培养基与种子培养液：种子培养基中包含蛋白胨30 g/L、牛肉膏 5 g/L、NaC1 7 g/L，同时其p H 值为7，并进行0.1Mpa下的30分钟的杀菌处理。同时在GA1培养面上选取一些菌落，并将其装到由种子培养基的摇瓶内。在温度为30摄氏度、速度为200 r/min的摇床中进行24小时的培养，则其中细菌的浓度将会达到 1.0×10 CFU/m L.进而就形成了 GA1产絮凝剂的种子培养液。（4）产絮凝剂培养基及培养过程：产絮凝剂的培养基中包含40g/L葡萄糖、K2HPO4 10 g/L、KH2PO4 4.0 g/L、NaC10.4 g/L、（NH4）2SO4 0.3 g/L、脲0.6 g/L、酵母浸膏0.2 g/L、Mg SO4 0.1 g/L，与此同时，培养基的p H值为8，并进行0.07Mpa的40min灭菌处理。除此之外，还要在温度为30摄氏度、摇床的速度为250 r/min的条件下，在所制成的种子培养液中培养48小时。（5）絮凝剂的提取方法：通常情况下，菌株 GA1产絮凝剂的水平由絮凝剂的产量来进行衡量的。因此，将菌株 GA1的培养液在5000 r/min下进行离心转30min，并收集上层的清液，而后加入到体积比为2：1的预冷无水丙酮中。并放置在6℃的冰箱中进行沉淀，其过程需要24h，能够使产生的沉淀稳定下来。带沉淀稳定下后，使用离心率为6000r/min，对其进行收集，并使4℃的无水乙醇對其进行数次的脱水。同时在脱水的过程中需要将相关的沉淀进行碾磨，使其成为粉碎状。再对其进行真空与干燥的处理，就会得到絮凝剂的粗产品，其呈现黄色粉末状。这种絮凝剂的絮凝活性非常高，当添加的量达到 0.4 g/L时，其悬浮液絮凝率可以达到 94%以上。（6）菌体生长的测定：对于菌体生长情况的测定，可以通过对细胞的干重进行测量，来判断菌体的生长情况。因此，就需要在速度为5000r/min中将培养液进行30分钟的离心培养，而后将其沉淀物用蒸馏水清洗，再进行离心。重复这项工作至少2次，最后再在100℃下烘干至恒重。

结果与讨论。（1）菌种鉴定：①形态学特征。该菌株在牛肉膏蛋白胨固体琼脂培养基上，其菌落没有呈现规则状扩散形态，同时在含有葡萄糖的培养基上，其菌落呈现半透明、隆起、粘稠的形态。②生理生化鉴定。该菌株为化能异养，能够利用葡萄糖发酵产生酸、气，接触酶呈现阳性，进行淀粉水解，VP试验也显示为阳性，同时也不产生吲哚。这些现象依照《伯杰氏细菌鉴定手册》的相关标准对照，可以初步断定其为芽孢杆菌属。③16S r DNA 序列相似性分析。通过使用通用引物 27F和 1495R 对提取到的GA1菌株的DNA样品进行检测，能够得到16S r DNA 的测序结果为：通过Blastn同源性检索，其结果为该菌株的16S r DNA 与 Paenibacillus polymyxa的16S r DNA 最为相似，可以达到99%的相似度。因此可以认为菌株 GA1为多粘类芽孢杆菌。（2）碳源和氮源对GA1产絮凝剂的影响：在GAI产絮凝剂培养基与其他条件都相同的情况之下，用不同的碳源与氮源来对培养基中的相关培养成分进行替换，其絮凝剂的产量与菌体生长的产量也是不同的。如图1、2所示。

由图1可知，GA1能够利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖等来完成絮凝剂的制作，并且由图可知采用蔗糖来制作的效果是最好的。由图2可以看出，GAI在有酵母浸膏、牛肉膏复杂有机氮源时，其絮凝剂的产量是最高的。而在硫酸铵、硝酸钾等无机氮源以及简单有机氮源的条件下，其菌体的生长情况是最好的。因此，我们可以得出，蔗糖是产絮凝剂的最好碳源，酵母浸膏是最好的氮源。（3）分段培养工艺：综合GAI菌体最佳的生长环境和最佳产絮凝剂的条件，可以将整个培养的过程分为两个部分，培养初期的24h内以及培养后期的48h。在刚开始培养的24小时内的环境是菌体生长的最好条件环境，而在培养最后的48小时的环境是菌体产絮凝剂的最佳培养条件。下图3为：在不同的培养方式条件下，GAI菌体产絮凝剂和菌体生长的相关示意图。

据图3所示，在30摄氏度的温度中，速度为 150 r/min摇床的条件下，菌体达到了最快的生长，但是与此同时，菌体在生长时消耗了大量的营养物质，因而其絮凝剂的产量比较低。在25℃，摇床速度为100 r/min的条件下，絮凝剂的产量最高，但同时其絮凝剂生产的周期却比较长。因此，使用分段培养的方法能够有效地解决菌体生长与产量之间的问题，尽可能的保证絮凝剂与培养周期之间的平衡。

结论

以蔗糖作为碳源、酵母浸膏作为氮源时，是多粘类芽孢杆菌GA1产絮凝剂的最佳情况。

采用分段培养工艺，将整个培养过程分为2段。在培养的初期24h内，在30摄氏度、150 r/min的摇床速度。以及在培养后期温度为25摄氏度，摇床速度为100 r/min的48小时内。初次之外，使用分段培养法能制造出尽可能多的絮凝剂，使其产量得以最大的保障。

（作者单位：马鞍山市产品质量监督检验所）