川丹通脉片中丹参酮ⅡA含量测定研究

汪 涛，胡卫东，李育芳，巴夏玲，程 波（.解放军武汉疗养院药械科，湖北 武汉 430074；.华中科技大学同济医学院药学院实验室，湖北 武汉 430030）

川丹通脉片中丹参酮ⅡA含量测定研究

汪 涛1，胡卫东1，李育芳1，巴夏玲1，程 波2
（1.解放军武汉疗养院药械科，湖北 武汉 430074；2.华中科技大学同济医学院药学院实验室，湖北 武汉 430030）

目的：建立川丹通脉片中有效成分丹参酮ⅡA含量测定HPLC方法。方法：选用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm）；以甲醇-水（75∶25）为流动相；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃。结果：HPLC法测定丹参酮ⅡA不存在干扰，丹参酮ⅡA进样量在1.486 ～ 44.570 µg·mL-1范围内时，线性关系良好；加样回收率为100.1%，RSD为1.37%。结论：该质量控制方法简便、稳定、可靠，可作为川丹通脉片中丹参酮ⅡA的含量测定方法。

川丹通脉片；丹参酮ⅡA；高效液相色谱法；含量测定

川丹通脉片为解放军武汉疗养院配制的纯中药制剂，军队医疗机构制剂批准文号：广制字（2013）F03002。该制剂由中药川芎、丹参、海风藤、猪牙皂、地龙组成，采取中药粉末与中药提取浸膏混合后制粒，颗粒干燥后压片的方法制备，属于半浸膏素片。具有活血化瘀，祛痰开窍，扩张血管，增进心、脑动脉血流量的功效。用于治疗心绞痛，心肌梗死，脑血栓形成等症。为更好地控制产品质量，使用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对川丹通脉片中丹参所含丹参酮ⅡA进行了含量测定，为该制剂建立完善的质量标准提供理论参考。

1 仪器与试药

Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国戴安公司）；色谱柱为welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm），Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm），Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）；LC-350A型超声波中药处理机（济宁市市中区鲁超仪器厂）。

丹参酮ⅡA对照品（中国食品药品检定研究院，批号110766-200619）。川丹通脉片（规格：0.3 g，批号150212、150305、150317）由解放军武汉疗养院提供。水为纯水机净化水（纯水机型号Millipore Milli-Q Biocel型纯水器）。甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

2 丹参酮ⅡA含量测定［1］

2.1色谱条件与系统适用性实验

色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）；以甲醇-水（75∶25）为流动相；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃。按丹参酮ⅡA色谱峰计算理论塔板数，应不得低于2000。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液 精密称取丹参酮ⅡA 6.19 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液（0.123 8 mg·mL-1）。再精密吸取对照品储备液3 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为14.86 µg·mL-1的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 取本品粉末约0.5 g（批号150212），精密称定，置具塞棕色锥形瓶内，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）15 min，冷却后称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3阴性对照溶液 取除去丹参以外的其它药材，按确定的制备工艺生产阴性供试品。按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3专属性实验

将上述3种溶液各10 µL，分别进样分析，色谱图中，丹参酮ⅡA色谱峰峰形对称，达到基线分离，阴性对照溶液无干扰，该方法专属性良好，见图1。

图1　川丹通脉片中丹参酮ⅡA含量测定色谱图A - 对照品，B - 供试品，C - 阴性对照；1 - 丹参酮ⅡAFig 1 The chromatograms of content determination of tanshinoneⅡA in Chuandan Tongmai tabletsA - reference substance， B - sample， C - negative reference substance；1 - tanshinoneⅡA

2.4线性关系的考察

分别精密吸取对照品储备液（0.123 8 mg·mL-1）0.6、1.2、3、6、12、18 mL，置50 mL具塞棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的对照品溶液。按浓度由低到高的顺序，依次精密吸取不同浓度的对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪中，测定丹参酮ⅡA峰面积。绘制标准曲线：纵坐标（Y）为色谱峰面积，横坐标（X）为质量浓度；线性回归方程为：Y = 0.974 0 X + 0.015 6，r = 1。结果表明：丹参酮ⅡA对照品在1.486 ～ 44.570 µg·mL-1范围内，线性关系良好［2］。

2.5仪器精密度实验

精密吸取同一供试品溶液（批号150212）10 µL，重复进样6次，测定峰面积，RSD为0.23%。结果表明仪器精密度良好［3］。

2.6重复性实验

取同一批供试品（批号150212）6份，分别按“2.2.2”项下方法制备，测定峰面积并计算含量，结果供试品中丹参酮ⅡA的平均含量为0.754 8 mg·g-1，RSD为0.67%［4］。

2.7稳定性实验

取同一批供试品（批号150212），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、16、24 h进样，记录峰面积，测定峰面积值的RSD为0.52%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8加样回收率实验

分别精密吸取对照品储备液（0.123 8 mg·mL-1）3、5、10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得不同浓度的丹参酮ⅡA对照品溶液（浓度分别为3.714 μg·mL-1、6.190 μg·mL-1、12.380 μg·mL-1）。再精密称取已知准确含量的同一批川丹通脉片（批号150212）共9份，分别精密加入上述不同浓度的丹参酮ⅡA对照品溶液25 mL，每个浓度制备3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 µL注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果显示丹参酮ⅡA的平均回收率为100.1%，RSD 为1.37%［4-5］，详见表1。

2.9耐用性实验

分别精密称取同一批号（批号150212）的川丹通脉片粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下，采用3种不同品牌的色谱柱，依法测定，结果如下：welch Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）：分离度 ＞ 5，理论塔板数15 715，含量为0.761 4 mg·g-1；Phenomenex Luna C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）：分离度＞ 5，理论塔板数9019，含量为0.750 3 mg·g-1；Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）：分离度＞ 5，理论塔板数15 094，含量为0.754 8 mg·g-1；RSD为0.74%，表明3种不同品牌色谱柱均能重现现有方法。

表1　加样回收率实验结果. n = 9Tab 1 The results of sample recovery rate test. n = 9

2.10供试品的含量测定

取本品3批，批号分别为150212、150305、150317，按正文“2.2”项下方法试验，结果见表2。

表2　供试品中丹参酮ⅡA的含量测定结果Tab 2 The result of content determination of tanshinoneⅡA in Chuandan Tongmai tablets

3 讨论

3.1含量测定指标成分的选择

川丹通脉片由5味中药材组成，现代药理实验证明川芎、丹参能扩张血管，增加心脑动脉血流量［6-12］，起到活血化瘀，行气开窍的作用，共为君药；地龙，清热定惊，为臣药；猪牙皂、海风藤有祛痰开窍功效，同为佐药。在建立川丹通脉片中有效成分含量测定方法的过程中，根据川丹通脉片所含5味药材所起作用及用量，分别对川芎、丹参中的有效成分进行含量测定实验。在对川芎的有效成分阿魏酸进行含量测定实验时，HPLC色谱图中色谱峰峰形不对称，峰形不标准，表明在测定阿魏酸含量的实验过程中，存在较大干扰。因此，川丹通脉片不宜采用阿魏酸进行含量测定。

丹参为方中君药，丹参酮ⅡA为丹参的专属性成分。在测定丹参酮ⅡA含量时，含量测定及加样回收实验均不存在干扰，故选择丹参酮ⅡA作为控制川丹通脉片质量的指标成分。

3.2流动相的选择

《中华人民共和国药典》2015年版一部中丹参项下测定丹参酮类含量，是进行HPLC梯度洗脱，由于设备条件有限，所以只采用高效液相色谱仪进行丹参酮ⅡA的含量测定。经反复实验，选定以甲醇-水（75∶25）为流动相进行测定，结果显示供试品溶液峰形较好，丹参酮ⅡA能够达到基线分离，故最终采用此作为流动相。

3.3丹参酮ⅡA含量限度的确定

由于《中华人民共和国药典》2015年版一部中对丹参中丹参酮类的含量有规定，根据实验情况，选择丹参酮ⅡA的含量为重点控制对象［13］。根据含量测定的结果及大量配制中的实际情况，建议川丹通脉片应含丹参酮ⅡA≥0.20 mg·片-1。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：通则0512.

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［3］ 杨道炬，张怀，刘树强，等.HPLC法测定消脂胶囊中丹参酮ⅡA和丹酚酸B的含量［J］.中药新药与临床药理，2014，25 （6）：737-740.

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［5］ 张鹤，马宁.HPLC法测定乳癖消结丸中丹参酮ⅡA、橙皮苷含量［J］.亚太传统医药，2015，11（12）：24-27.

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Determination of tanshinoneⅡA in Chuandan Tongmai tablets

WANG Tao1， HU Wei-dong1， LI Yu-fang1， BA Xia-ling1， CHENG Bo2
（1. The Drug and Equipment Section of Wuhan Sanatorium of People's Liberation Army， Wuhan 430074， China； 2. The Schools' Laboratory of Pharmacy in Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030， China）

Objective: To establish a determination method of active ingredient in Chuandan Tongmai tablets. Methods: The Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18column （4.6 mm × 250 mm， 5 µm） was used， with the mobile phase consisted of methanol-water （75∶25）. The detection wavelength was set at 270 nm， velocity of flow was 1.0 mL·min-1， the column temperature wa 35 ℃. Results: The tanshinoneⅡA was not intervened with other impurities in this HPLC method. The calibration curve was linear when the concentrations of tanshinoneⅡA were within the range of 1.486 - 44.570 µg·mL-1. The average recovery was 100.1% （RSD = 1.37%）. Conclusion: The method is simple， stable， reliable， and can be adopted as the quality control method.

Chuandan Tongmai tablets； TanshinoneⅡA； HPLC； Content determination

R917

A

1672 - 8157（2016）04 - 0214 - 03

2015年军队医疗机构制剂标准提高计划项目（14TG0199）

汪涛，男，主管药师，研究方向：医院药学、中药制剂。E-mail：taidi1127@126.com

2016-03-04

2016-05-23）