通痹化湿颗粒质量标准研究

2016-09-08靳子明甄小龙甘肃中医药大学附属医院甘肃兰州730020甘肃省中药炮制及质控工程技术研究中心甘肃兰州730020

卫生职业教育 2016年15期

窦　霞，靳子明，甄小龙（1.甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州 730020；2.甘肃省中药炮制及质控工程技术研究中心，甘肃兰州 730020）

通痹化湿颗粒质量标准研究

窦霞1，2，靳子明1，2，甄小龙2*
（1.甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州 730020；2.甘肃省中药炮制及质控工程技术研究中心，甘肃兰州 730020）

目的建立通痹化湿颗粒质量标准。方法采用薄层色谱法对制剂中青风藤、鸡血藤、千年健及威灵仙进行定性鉴别；采用高效液相色谱法对处方中青风藤所含青藤碱的含量进行测定。Waters XTerra RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；甲醇-磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L的磷酸二氢钠溶液，以1%三乙胺调节pH值至9.0）（58∶42）作为流动相；检测波长为262 nm。结果建立了青风藤、鸡血藤、千年健及威灵仙具有专属性的定性鉴别方法；青藤碱含量测定加样回收率为95.69%，RSD为0.79%。结论本方法简便可靠，重复性好，可用于该制剂的质量控制。

通痹化湿颗粒；质量标准；定性鉴别；青藤碱；含量测定

通痹化湿颗粒是我院风湿科专家经验方，由青风藤、鸡血藤、秦艽、络石藤、千年健、威灵仙等8味药组成，具有通经活络，蠲痹止痛，祛风化湿的功效。主要用于治疗急性痛风性关节炎、类风湿关节炎及其他风湿性关节炎证属肝肾不足、风湿阻络证。本方经医院临床多年使用，疗效确切，故将其开发为院内制剂。为了提高院内制剂质量的可控性，分别研究制定方中四味药材的薄层鉴别和一个含量测定项，用以控制本品的质量。现将其质量标准研究方法报告如下。

1　仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪；MWD型紫外可见检测器；Waters XTerra RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱。青藤碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0774-201206，供含量测定用）；甲醇：色谱纯（美国天地公司）；其余试剂均为分析纯；通痹化湿颗粒，甘肃中医药大学附属医院自制（批号：111010）。

2　方法与结果

2.1通痹化湿颗粒薄层色谱鉴别

2.1.1青风藤薄层色谱鉴别［1，2］取本品4 g，研细，加70%乙醇30 ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 ml溶解，作为供试品溶液。再取青风藤阴性对照样品，同法制成阴性对照液。另取青藤碱对照品适量，加乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。按薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述供试品溶液及对照品溶液各5μl，分别点于同一含有2%氢氧化钠的硅胶GF254薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶3∶1）10℃以下放置的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检识。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的荧光斑点。

2.1.2鸡血藤薄层色谱鉴别［3］取本品1袋，研细，加乙醚30 ml冷浸30分钟，时时振摇，倾出乙醚后，残渣加85%乙醇50 ml超声（250 w，40 kHz）处理20分钟，滤过，滤液蒸干后加水20 ml溶解，转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯40 ml提取，回收乙酸乙酯，残渣加乙醇0.5 ml使其溶解，作为供试品溶液。另取鸡血藤对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。按薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯（9∶4）为展开剂，展开，取出，晾干。置紫外光灯（365 nm）下检识。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

2.1.3千年健薄层色谱鉴别取本品1袋，加水50 ml加热回流提取30分钟，放冷，过滤，滤液加乙醚30 ml萃取2次，每次30 ml，取乙醚液蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至1 ml，作为供试品溶液。另取千年健对照药材1 g，加水30 ml，加热回流提取1小时，滤过，取滤液10 ml，乙醚萃取3次，每次10 ml，蒸干乙醚，残渣加甲醇溶解并定容至1 ml，作为对照药材溶液。按薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.1.4威灵仙薄层色谱鉴别［4］取本品1袋，加水20 ml超声（250 w，40 kHz）处理30分钟，过滤，加二氯甲烷萃取3次，每次30 ml，合并萃取液，浓缩至干，用二氯甲烷1 ml溶解残渣，作为供试品溶液。另取威灵仙对照药材1 g，加少量水润湿30分钟，加入正丁醇50 ml回流提取3次，每次3小时，过滤，滤液合并，回收正丁醇，加二氯甲烷1 ml溶解残渣，制成对照药材溶液。按薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-乙醚（7∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检识。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

2.2通痹化湿颗粒中青藤碱含量测定［1，5，6］

2.2.1色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂；甲醇-磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L的磷酸二氢钠溶液，以1%三乙胺调节pH值至9.0）（58∶42）作为流动相；检测波长为262 nm。理论板数按青藤碱峰计算，应不低于5 000。

2.2.2溶液的制备（1）对照品溶液的制备：取青藤碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含136 μg的溶液，即得。

（2）供试品溶液的制备：取装量差异项下本品，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶内，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声（250 W，40 kHz）处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

（3）阴性对照品溶液制备：取阴性样品（缺青风藤），按供试品溶液制备方法制备阴性供试品溶液。

2.2.3系统适用性研究在上述条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，结果表明，阴性供试品对青藤碱峰无干扰（见图1）。青藤碱峰理论塔板数大于5 000，分离度大于1.5，已达到基线分离，拖尾因子符合要求。为确保定量分析的准确性，在系统实验中青藤碱的理论板数不得低于5 000。

A.对照品溶液　B.供试品溶液　C.阴性供试品溶液图1　各溶液高效液相色谱图

2.2.4线性关系考察精密称取青藤碱对照品13.70 mg，置20 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为685 μg/ml的标准品储备液。分别精密吸取上述溶液0.5 ml，1.0 ml，2.0 ml，4.0 ml，10 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别进样5 μl，以进样浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。结果表明青藤碱在34.25 μg/ml～685 μg/ml范围内呈良好线性关系，回归方程为Y=4.859 2X+4.449 1，r=1.000 0。

2.2.5精密度试验精密吸取对照品（137μg/ml）溶液5 μl，重复进样6次，测得峰面积积分值，计算RSD=0.80%。

2.2.6稳定性试验取本品按正文含量测定项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液5μl，分别于第0、1、2、4、8、12小时进样一次，共进样6次，测得峰面积积分值，计算RSD=0.38%。结果表明青藤碱峰面积在12小时内稳定。

2.2.7重复性试验取本品研细，取6份，每份取约2 g，精密称定，按正文含量测定项下的供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液5 μl进行测定，计算含量。结果表明该法测定青藤碱含量重复性良好，青藤碱平均含量为1.70 mg/g，RSD=0.48%。

2.2.8加样回收率试验取本品研细，分6份，每份约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶内，精密加入851 μg/ml的青藤碱对照品溶液2 ml，挥干溶剂后，再精密加入甲醇25 ml，以下按正文含量测定项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进行含量测定，并计算回收率。结果表明回收率符合要求（95%～105%），该方法回收率良好（结果见表1）。

表1　加样回收率试验结果

2.2.9样品含量测定取本品3批（批号141010、141101、150103）制剂样品，按正文含量测定项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各5 μl，注入高效液相色谱仪，测定，计算，结果见表2。

3　讨论

（1）方中青风藤为君药，故对青风藤中的主要有效成分青藤碱做了含量测定，参考药典方法［1］，对色谱条件做了系统考察，结果表明甲醇-磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L的磷酸二氢钠溶液，以1%三乙胺调节pH值至9.0）（58∶42）系统作为流动相可使供试品色谱中青藤碱峰与其他峰能够达到很好的分离，且阴性样品无干扰。又对供试品提取溶剂、提取时间及溶剂用量做了考察。通过对提取效率、供试品溶液的颜色、色谱图的杂质及操作过程是否方便等因素的全面考察，确定了供试品溶液的制备方法。

（2）本质量标准制定中，参考药典方法对制剂中所有药材进行薄层鉴别研究，但因药味较多，部分药材鉴别有阴性干扰，药典方法多不适用，在此基础上通过多次试验摸索，最终确定了青风藤、鸡血藤、千年健及威灵仙的最佳薄层鉴别方法，均无阴性干扰，专属性较强，故列入本品质量标准。

（3）本项目研究中，对常规检查项目按照药典标准一一做了研究并制定标准。重点研究处方中各药的定性鉴别和有效成分的含量测定，对处方中一半的药物做了定性质量控制，并引入高效液相色谱法控制制剂的含量，这在院内制剂研发中，其质量标准属于领先水平。