过表达DKK1、Sost重组腺病毒载体的构建及其对MG63细胞和相关蛋白的影响

2016-09-08万雷黄宏兴黄红柴生颋魏合伟张志海王吉利

广州中医药大学学报 2016年4期

关键词：腺病毒成骨细胞空白对照

万雷，　黄宏兴，　黄红，　柴生颋，　魏合伟，　张志海，　王吉利

（1.广州中医药大学附属骨伤科医院，广东广州　510240；2.广州中医药大学，广东广州　510405）

过表达DKK1、Sost重组腺病毒载体的构建及其对MG63细胞和相关蛋白的影响

万雷1，黄宏兴1，黄红2，柴生颋1，魏合伟1，张志海1，王吉利2

（1.广州中医药大学附属骨伤科医院，广东广州510240；2.广州中医药大学，广东广州510405）

【目的】针对Wnt信号通路抑制因子Dickkopf（DKK）1、骨硬化蛋白Sclerostin（Sost）基因构建过表达重组腺病毒载体，观察其对MG63细胞和相关蛋白的影响。【方法】构建DKK1、Sost过表达重组腺病毒载体，将培养好的MG63细胞分为空白对照组、空载病毒组（NC对照组）、过表达DKK1组、过表达Sost组、过表达DKK1+Sost组5组，根据组别不同分别用上述过表达重组腺病毒感染MG63细胞，观察细胞增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性、钙离子浓度和骨调节蛋白表达情况。【结果】与空白对照组比较，过表达DKK1组、过表达Sost组、过表达DKK1+Sost组的细胞光密度值、ALP活性值均显著降低，而钙离子浓度显著升高，以过表达DKK1+Sost组变化最明显（P＜0.01）。与空白对照组比较，过表达DKK1组、过表达Sost组、过表达DKK1+Sost组的骨保护蛋白（OPG）、低密度脂蛋白受体相关蛋白（Lrp）5、骨形态发生蛋白（BMP）2、结缔组织生长因子（CTGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）2、骨桥蛋白（OPN）表达量均降低，而肿瘤坏死因子（TNF）-α表达量则升高，以过表达DKK1+Sost组变化最明显，组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。【结论】过表达DKK1、Sost可降低MG63细胞增殖和ALP活性，升高钙离子浓度，对骨调节蛋白有一定影响，尤以两者同时过表达时的作用最强。

DKK1；Sost；过表达基因；腺病毒；MG63细胞；细胞培养

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是由于年龄增加，性腺功能减退所导致的骨代谢疾病，严重危害老年人的健康。Wnt信号通路是近年来发现的与骨代谢关系密切的一个重要胞内信号传导通路，现有研究已发现众多的胞内蛋白质分子参与Wnt信号的转导与调节［1］。而Wnt信号通路抑制因子Dickkopf （DKK）1和骨硬化蛋白Sclerostin（Sost）是Wnt信号通路的负调控因子，在Wnt信号通路介导的骨形成和骨代谢过程中发挥了重要作用，被视为骨相关疾病如骨质疏松、骨修复的治疗靶点［2］。为了深入研究骨发育和骨重塑的分子机制，本研究构建了过表达DKK1、Sost重组腺病毒载体，并观察其对MG63细胞及相关蛋白的影响，现报道如下。

1　材料和方法

1.1试剂和仪器人成骨肉瘤细胞（MG63）由中国科学院上海细胞所细胞库提供；DMEM培养基、胎牛血清、Pen/Strep和Opti-MEM培养基均购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000 Trizol Reagent、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、Taq DNA聚合酶均购自美国Invitrogen公司；胶回收/纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根生物有限公司；BJ5183感受态细胞购自上海杰美基因公司；DH5α感受态细胞购自北京鼎国生物有限公司；KpnⅠ、XhoⅠ、PmeⅠ、PacⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自美国NEB公司；蛋白酶K、ALP活性检测试剂盒购自上海碧云天生物有限公司；抗Wnt信号通路抑制因子DKK1抗体购自美国CST公司；抗骨硬化蛋白（Sost）抗体、抗骨形态发生蛋白（BMP）2抗体、抗骨桥蛋白（OPN）抗体、抗骨保护蛋白（OPG）抗体、抗肿瘤坏死因子（TNF）-α抗体均购自美国Abcam公司；RIPA细胞裂解液、Triton 100、EGTA、四甲基偶氮唑盐（MTT）购自美国Sigma公司；Calcium OtangeTM Indicators购自美国Molcular Probes公司；抗结缔组织生长因子（CTGF）抗体、抗低密度脂蛋白受体相关蛋白（Lrp）5抗体、抗成纤维细胞生长因子（FGF）2抗体购自美国Santa公司；蛋白Marker购自美国Fermentasa公司；蛋白酶抑制剂/磷酸化抑制剂、ECL发光液购自德国Merck公司。DHP-9052细胞培养箱（中国上海一恒公司）；SW-CJ-1FD超净工作台（中国江苏苏净公司）；H1650-W/H1650W高速低温离心机（中国湘仪公司）；TC-S普通PCR仪（中国博日公司）；ABI7500荧光定量PCR仪（美国Thermo公司）；IX73倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；Mini-PROTEAN Tetra电泳仪（美国 Bio-Rad公司）；Mini Trans-Blot蛋白转印仪（美国Bio-Rad公司）；ChemiDoc MP凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；Nanodrop-2000微量核酸定量仪（美国Thermo公司）。

1.2细胞培养和总RNA提取MG63细胞以1×106个/mL接种于T75培养瓶，加入适量DMEM高糖培养基［含体积分数10%胎牛血清（FBS），1%青霉素—链霉素（Pen/Strep）］于体积分数5%CO2的细胞培养箱内培养。待长至80%左右融合，消化、收集细胞，以1∶3比例进行传代。弃培养瓶内旧培养基，以预冷PBS洗涤细胞3次，吸尽液体，加入1 mL Trizol，提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。

1.3目的基因过表达重组腺病毒载体构建在NCBI数据库查询参考核苷酸序列DKK1（801 bp）、Sost（642 bp），采用Primer 5.0设计PCR引物，并添加KpnⅠ、NotⅠ酶切位点。以cDNA为模板，扩增DKK1、Sost基因，与穿梭质粒pENTER、PCR产物KpnⅠ、NotⅠ双酶切，在T4 DNA酶作用下将DKK1、Sost基因与穿梭质粒连接，连接产物转化感受态DH5α，挑选抗性克隆进行酶切鉴定，转化子涂布Kan+抗性平板，对提取的重组穿梭质粒用KpnⅠ、XhoⅠ双酶切进行测序鉴定。PmeⅠ酶切线性化重组质粒，PacⅠ酶切鉴定重组腺病毒质粒，将鉴定正确的重组腺病毒包装质粒命名为过表达DKK1（Ad-DKK1）、过表达Sost（Ad-Sost）。重组腺病毒包装质粒经Pac I酶切线性化后，用Lipofectamine 2000脂质体转染HEK-293细胞，收集病毒液，测定病毒滴度。

1.4细胞转染MG63细胞培养24 h后分为空白对照组、空载病毒组（NC对照组）、过表达DKK1 （Ad-DKK1）组、过表达Sost（Ad-Sost）组、过表达DKK1+Sost（Ad-DKK1+Ad-Sost）组5组，分别用重组腺病毒Ad-DKK1、Ad-Sost分别/同时感染各组MG63细胞，感染复数（MOI）为50。重组腺病毒感染48 h后，分别消化收集细胞，采用qPCR、Western Blot检测DKK1、Sost在MG63细胞中的表达，以确定过表达重组腺病毒感染MG63后Sost、DKK1基因发生转录。qPCR实验结果利用ABI7500公司自带的PCR系统软件分析，观察扩增曲线。采用2－△△Ct相对定量法进行统计分析。其中△Ct＝Ct目的基因-Ct内参基因，△△Ct＝△Ct待测样品中目的基因-△Ct对照样品中目的基因，相对样品模板量＝2－△△Ct。设定空白组某个样本的检测结果为参照基准（数值为1），计算出其他样本结果，并进行组间比较。Western Blot实验结果使用Image J软件处理系统进行图像分析，计算目的蛋白光密度值，以目的蛋白光密度值与标准内参光密度值的比值（p）来表示结果。

1.5细胞增殖、ALP活性、钙离子浓度检测MG63细胞感染重组腺病毒48 h后，分空白对照组、过表达DKK1（Ad-DKK1）组、过表达Sost（Ad-Sost）组、过表达DKK1+Sost（Ad-DKK1+Ad-Sost）组4组，弃旧培养基，消化收集细胞，分别采用MTT法检测MG63细胞增殖，用酶标仪490 nm测定光密度（D）值，考马斯亮蓝蛋白定量后测定ALP活性，流式法分析细胞钙离子浓度。

1.6骨调节蛋白OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN、TNF-α的检测MG63细胞感染重组腺病毒48 h后，分空白对照组、过表达DKK1 （Ad-DKK1）组、过表达Sost（Ad-Sost）组、过表达DKK1+Sost（Ad-DKK1+Ad-Sost）组4组，弃旧培养基，消化收集细胞，提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度，上样、电泳、转膜、免疫反应，化学发光显色后进行图像分析。

1.7统计方法采用SPSS 18.0统计软件，数据用均数±标准差（±s）表示。因方差齐性的假定不满足，故采用无方差齐性假设的多重比较方法Tamhane’s。其他检测结果采用q检验和Duncan检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Ad-DKK1、Ad-Sost重组腺病毒载体构建目的基因的核苷酸序列见表1。

表1　目的基因的核苷酸序列Table 1　Nucleotide sequence of the objective genes

2.2Ad-DKK1、Ad-Sost重组腺病毒感染MG63后各组DKK1、Sost基因相对表达量表2、表3和图1结果表明：与空白对照组和NC对照组比较，Ad-DKK1、Ad-Sost重组腺病毒感染MG63细胞后DKK1、Sost mRNA水平均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01），表明Ad-DKK1、Ad-Sost重组腺病毒可以有效感染MG63细胞，且感染后DKK1、Sost基因发生了转录。

表2　Ad-DKK1重组腺病毒感染MG63后各组DKK1基因相对表达量比较Table 2　Comparison of the relative mRNA expression of DKK1 in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 recombinant adenovirus　（±s，n2－△△Ct）

①P＜0.01，与空白对照组比较；②P＜0.01，与NC对照组比较

组别空白对照组NC对照组Ad-DKK1组Ad-DKK1+Ad-Sost组N 3 3 3 3 DKK1 1.00±0.05 1.16±0.08 5.09±0.41①②3.95±0.25①②

表3　Ad-Sost重组腺病毒感染MG63后各组Sost基因相对表达量比较Table 3　Comparison of the relative mRNA expression of Sost in various groups after MG63 cells being infected with Ad-Sost recombinant adenovirus　（±s，n2－△△Ct）

①P＜0.01，与空白对照组比较；②P＜0.01，与NC对照组比较

组别空白对照组NC对照组Ad-Sost组Ad-DKK1+Ad-Sost组N 3 3 3 3 Sost 1.02±0.22 1.34±0.07 11.85±1.06①②10.93±0.94①②

图1　DKK1、Sost和GAPDH扩增曲线和熔解曲线图Figure 1　The amplification plot and melting curve of DKK1，Sost and GAPDH

2.3Ad-DKK1、Ad-Sost重组腺病毒感染MG63后各组DKK1、Sost的蛋白表达表4、表5和图2结果表明：与空白对照组和NC对照组比较，Ad-Sost、Ad-DKK1重组腺病毒感染MG63后Sost、DKK1在MG63细胞中的表达均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表4　Ad-DKK1重组腺病毒感染MG63后DKK1蛋白表达比较Table 4 Comparison of the protein expression of DKK1 in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 recombinant adenovirus　（±s，p）

①P＜0.01，与空白对照组比较；②P＜0.01，与NC对照组比较

表5　Ad-Sost重组腺病毒感染MG63后Sost蛋白表达比较Table 5　Comparison of the protein expression of Sost in various groups after MG63 cells being infected with Ad-Sost recombinant adenovirus　（±s，p）

①P＜0.01，与空白对照组比较；②P＜0.01，与NC对照组比较

组别空白对照组NC对照组Ad-Sost组Ad-DKK1+Ad-Sost组N 3 3 3 3 Sost 0.31±0.05 0.33±0.05 0.86±0.06①②0.83±0.05①②

图2　各组DKK1、Sost表达凝胶电泳图（Western blot法）Figure 2　Gel electrophoresis results for DKK1 and Sost expression in various groups（by Western blot method）

2.4Ad-DKK1、Ad-Sost对各组MG63细胞增殖、ALP活性、钙离子浓度的影响结果表6结果显示：与空白对照组比较，Ad-DKK1组、Ad-Sost组和Ad-DKK1+Ad-Sost组的细胞活性均明显降低，钙离子浓度均明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与空白对照组比较，Ad-Sost组和Ad-DKK1+Ad-Sost组的ALP活性均降低，差异有统计学意义（P＜0.01），而Ad-DKK1组的ALP活性虽较空白对照组也降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与Ad-DKK1组比较，Ad-Sost组和Ad-DKK1+Ad-Sost组的细胞活性、ALP活性均显著降低，钙离子浓度均显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与Ad-Sost组比较，Ad-DKK1+Ad-Sost组的细胞活性、ALP活性均降低，钙离子浓度增高，细胞活性和钙离子浓度比较差异有统计学意义（P＜0.01），而ALP活性比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表6　Ad-DKK1、Ad-Sost对各组MG63细胞增殖、ALP、钙离子浓度影响Table 6　Comparison of the cell viability，ALP activity，and Ca2+concentration in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 and Ad-Sost recombinant adenovirus　（±s）

①P＜0.01，与空白对照组比较；②P＜0.01，与Ad-DKK1组比较；③P＜0.01，与Ad-Sost组比较

组别空白对照组Ad-DKK1组Ad-Sost组Ad-DKK1+Ad-Sost组N 3 3 3 3 D（λ=490 nm）100±6.952 77.808±4.484①59.764±6.973①②45.171±5.975①②③JALP/（U·μL-1）5.925±0.251 5.364±0.300 3.287±0.363①②3.044±0.368①②cca2+/（nmol·L-1）118.7±12.22 207.01±7.39①254.51±21.55①②283.58±14.8①②③

2.5Ad-DKK1、Ad-Sost对MG63细胞中骨调节蛋白的影响结果表7结果显示：与空白对照组比较，3组OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN均降低，而TNF-α升高，尤以Ad-DKK1+Ad-Sost组变化最显著。与空白对照组比较，Ad-DKK1组Lrp5、CTGF、FGF2、OPN差异有统计学意义（P＜0.05）；Ad-Sost组 Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN、TNF-α差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；Ad-DKK1+Ad-Sost组 OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN、TNF-α差异有统计学意义（P＜0.01）。与Ad-DKK1组比较，Ad-Sost 组OPG、Lrp5、BMP2、FGF2、OPN均有降低，而CTGF、TNF-α稍升高，两组 Lrp5比较差异有统计学意义（P＜0.05）；Ad-DKK1+Ad-Sost组的OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN均降低，TNF-α稍升高，两组OPG、Lrp5、CTGF、FGF2、OPN比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与Ad-Sost组比较，Ad-DKK1+Ad-Sost组的 OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN均降低，TNF-α稍升高，2组OPG、CTGF、FGF2比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

3　讨论

近年有研究表明Wnt信号通路在骨组织的生长发育以及个体成年后的骨代谢平衡中扮演重要角色，抑制Wnt通路会引起骨代谢异常，导致骨质疏松，激活Wnt信号通路会促进骨形成，是目前骨骼系统相关疾病发病机制和骨代谢研究的新热点［3］。现有研究已发现众多的胞内蛋白质分子参与Wnt信号的转导与调节，DKK1和Sost是Wnt信号通路的负调控因子，在Wnt信号通路介导的骨形成和骨代谢过程中发挥了重要作用［2］。由Sost基因表达的硬骨素作为骨形成抑制蛋白，是一种刚发现的调控骨形成的负性因子，属于胱氨酸结构超家族的一员［4］。Sost能够特异性地在成熟骨骼的骨细胞中表达［5］。研究显示：Sost能竞争性结合Wnt信号通路中的共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白（Lrp5）来抑制该信号通路，从而引起骨形成障碍［6-7］。有研究对大鼠的基因进行分析，发现Sost基因缺失的大鼠可慢慢呈现高骨量状态，并且通过转基因技术使大鼠Sost基因呈高表达状态可以使大鼠因骨量丢失而发生严重的骨质疏松，可见Sost与骨形成关系密切［8-9］。DKK1是骨形成过程中的另一个抑制因子，在许多骨骼疾病和某些肿瘤的发生发展过程中起着非常重要作用，其对Wnt信号通路也有抑制作用，作用机理与Sost作用机理相同，其作用途径大都通过Wnt信号通路来实现［10-11］。DKK1首先与Wnt信号通路受体Lrp5直接或间接结合，竞争性拮抗Wnt蛋白与其受体的结合，进而形成多聚体复合物，促使胞内信号分子β-catenin磷酸化，使其在细胞浆内被水解，该过程阻断β-catenin进入细胞核与TCF/LCF转录因子结合，进而竞争性地阻断Wnt信号通路的正常传导［12］。本研究发现过表达DKK1、Sost重组腺病毒感染MG63细胞后，可以降低MG63细胞活性和ALP活性，提高细胞中的钙离子浓度，尤以过表达DKK1+Sost组变化最明显，提示这是由于过表达的DKK1、Sost基因竞争性结合Wnt信号通路中的共受体Lrp5而抑制该信号通路的开放，从而引起MG63细胞增殖能力和ALP活性下降，为DKK1、Sost过表达可引起骨形成不足，骨量丢失提供了新的实验证据，目前未见类似过表达重组腺病毒转染MG63细胞的研究报道。

表7　Ad-DKK1、Ad-Sost对各组MG63细胞中骨调节蛋白的影响Table 7 Comparison of the related bone regulating proteins expression in various groups after MG63 cells being infected with Ad-DKK1 and Ad-Sost recombinant adenovirus　［±s，c/（μmol·L-1）］

①P＜0.05，②P＜0.01，与空白对照组比较；③P＜0.05，④P＜0.01，与Ad-DKK1组比较；⑤P＜0.01，与Ad-Sost组比较

组别空白对照组Ad-DKK1组Ad-Sost组Ad-DKK1+Ad-Sost组N 3 3 3 3 OPG 1.00±0.02 0.79±0.02 0.75±0.02 0.32±0.007②④⑤Lrp5 1.00±0.01 0.71±0.02①0.42±0.01②③0.33±0.01②④BMP2 1.00±0.01 0.86±0.05 0.68±0.03①0.55±0.03②CTGF 1.00±0.01 0.56±0.01②0.6±0.01②0.17±0.02②④⑤FGF2 1.00±0.01 0.75±0.02①0.64±0.01②0.19±0.01②④⑤OPN 1.00±0.04 0.65±0.02①0.42±0.01②0.39±0.01②③TNF-α 1.00±0.05 1.33±0.04 1.54±0.02②1.67±0.04②

正常骨代谢平衡有赖于成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收协调统一。成骨细胞一方面通过合成骨基质增加骨量，另一方面通过其分泌的肿瘤坏死因子（TNF）-α、骨保护蛋白（OPG）、骨桥蛋白（OPN）等调节破骨细胞形成、活化，影响骨吸收。TNF-α是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，并参与正常炎症反应和免疫反应。它不仅可增加破骨细胞前体细胞数量，而且可增加破骨细胞介导的骨吸收，对成骨细胞功能也有直接影响［13-14］。OPG是肿瘤坏死因子受体家族成员，成骨细胞分泌的OPG是核因子κB受体活化子配体的可溶性假受体，可通过与核因子κB受体活化因子配体结合，竞争性阻止核因子κB受体活化因子配体与破骨细胞中的核因子κB受体活化因子结合，抑制破骨细胞形成和活化［15］。OPG还可阻断TNF-α诱导的成骨细胞凋亡，减少TNF-α转基因鼠的骨丢失［16］。Lrp5是一种细胞膜表面蛋白，是低密度脂蛋白受体家族成员中一员。最新研究表明，Lrp5存在于成骨细胞的表面，它的表达改变及功能丢失，可导致体外培养鼠头盖骨质密度减低，骨质厚度变薄，并在人的成长过程中影响骨质获得［17］。Lrp5参与的骨量调控机制为骨质疏松症等疾病提供了新的治疗靶点。骨形态发生蛋白（BMP）2是转化生长因子-β超家族成员之一，是一种分泌性多功能蛋白。在骨形成过程中，BMP2通过自/旁分泌，在细胞及细胞间质之间传导信息，调节细胞的分化和增生，具有诱导未分化的间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨的生长发育及其重建过程［18］。结缔组织生长因子（CTGF）是一种新的可刺激成纤维细胞增殖和分泌胶原的生长因子，还具有促细胞增殖、迁移及分化等作用［19］。成纤维细胞生长因子（FGF）2在骨和软骨形成等发育和生理过程中的许多关键细胞级联反应中具有调节作用［20］。体内实验［21-22］证实，FGF-2是骨发育及形成过程中的重要调节因子，通过全身或局部给予FGF-2可增加生长发育中的大鼠骨膜内骨形成。骨桥蛋白（OPN）是一种多功能分泌型糖蛋白，在骨基质的矿化、吸收以及骨重塑等过程中均能发挥重要作用，介导骨组织细胞与骨基质间的桥接，广泛参与了骨相关疾病的病程进展，显示出多效的生物学活性［23］。

本研究对感染过表达DKK1、Sost重组腺病毒的具有人成骨细胞表型特征的MG63细胞进行骨调节蛋白检测，结果显示：过表达DKK1、Sost可降低OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN表达量，提高TNF-α表达量（P＜0.05或P＜0.01）。此外过表达DKK1、Sost感染MG63细胞后，3组相关骨调节蛋白OPG、Lrp5、BMP2、CTGF、FGF2、OPN的表达量均较空白对照组降低，而TNF-α则升高，尤以DKK1和Sost共表达组明显。DKK1和Sost是Wnt信号通路的负调节因子，可以竞争性结合Wnt信号通路中的共受体Lrp5来抑制该信号通路的正常信号传导，导致成骨细胞增殖分化能力下降，最终导致成骨细胞分泌的促骨形成蛋白下降，而促骨吸收蛋白相对升高。本研究观察了过表达DKK1、Sost对MG63细胞增殖、ALP活性和钙离子浓度及相关骨调节蛋白的影响作用，有助于进一步分析Wnt信号通路抑制因子DKK1、Sost在骨形成中的作用，可为通过抑制DKK1、Sost而诱导Wnt信号通路来调节骨骼的重建过程提供实验基础。

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【责任编辑：黄玲】

Construction of DKK1，Sost Overexpressing Recombinant Adenovirus Vector and Effect of Overexpression on MG63 Cells and Related Proteins

WAN Lei1，HUANG Hongxing1，HUANG Hong2，CAI Shengting1，WEI Hewei1，ZHANG Zhihai1，WANG Jili2

（1.The Affiliated Orthopedics and Traumatology Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510240 Guangdong，China；2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

ObjectiveTo construct recombinant adenovirus vector with overexpression of Wnt signal pathway inhibitors of Dickkopf 1（DKK1）and Sclerostin（Sost），and to investigate the effect of the overexpression of inhibitors on MG63 cells and related proteins.Methods The DKK1，Sost overexpressing recombinant adenovirus vector was constructed，and the cultured mature MG63 cells were divided into blank control group，non-virusload control group（NC group），DKK1 overexpression group，Sost overexpression group，and DKK1+Sost overexpression group.MG63 cells of different groups were infected by the corresponding DKK1，Sost overexpressing recombinant adenovirus，and then we observed the cell viability，alkaline phosphatase（ALP）activity，and Ca2+concentration and related bone-regulating proteins expression.Results Compared with the blank control group，the cells optical density（OD）value and ALP activity were significantly decreased，and Ca2+concentration was significantly increased in DKK1 overexpression group，Sost overexpression group，and DKK1+Sost overexpression group，and the changes of the observation indexes were more obvious in DKK1+Sost overexpression group（P＜0.01）.Compared with the blank control group，the expression levels of osteoprotegerin （OPG），low-density lipoprotein receptor-related protein 5（Lrp5），bone morphogenetic protein 2（BMP2），connective tissue growth factor（CTGF），fibroblast growth factor 2（FGF2），and osteopontin（OPN）were decreased，the expression quantity of tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）was increased in the three overexpression groups，and the changes of the observation indexes were more obvious in DKK1+Sost overexpression group，the inter-group difference being significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion The overexpression of DKK1，Sost can decrease the MG63 cell viability and ALP activity，increase Ca2+concentration，and has certain effects on related bone regulating proteins，and the effects of the overexpression of DKK1 together with Sost are strongest.

DKK1；Sost；overexpressed gene；adenovirus；MG63 cells；cell culture

R392.11

1007-3213（2016）04-0578-07

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.031

2016-03-01

万雷（1979-），男，副主任中医师，博士研究生；E-mail：gzwl802@163.com

国家自然科学基金课题（编号：81302991）；广东省自然科学基金课题（编号：S2013040016828，2014A030310127）；广东省科技计划项目（编号：2013B021800058）；广州中医药大学青年英才项目（编号：QNYC20120119）；2014广东省“优青计划”项目（编号：yq2014041）