糖尿病膀胱功能障碍小鼠的膀胱功能及尿动力学改变

谈博，　连大卫，　黄涌鑫，　范平龙，　操红缨，　黄萍

（广州中医药大学，广东广州　510006）

糖尿病膀胱功能障碍小鼠的膀胱功能及尿动力学改变

谈博，连大卫，黄涌鑫，范平龙，操红缨，黄萍

（广州中医药大学，广东广州510006）

【目的】探讨糖尿病膀胱功能障碍小鼠的尿动力指标、小鼠膀胱功能的变化，为进一步探讨中药活性成分作用机制奠定基础。【方法】选用C57BL/6雄性小鼠，随机分为空白对照组、模型组，空白对照组给予普通饲料，模型组给予高脂纯化配方饲料，连续喂养4周。模型组腹腔注射链脲佐菌素（剂量为200 mg/kg），空腹血糖值到达10.5 mmol/L视为造模成功；造模成功后继续喂养12周，测定口服葡萄糖耐量（OGTT）、糖化血清蛋白（GSP）、空腹血糖值（FBG）和胰岛素（INS）；进行小鼠尿动力学测定，并用powerlab生物信号系统测小鼠膀胱肌条功能；对膀胱组织行苏木素—伊红（HE）和Masson染色后采用光镜观察病理情况。【结果】造模12周后，与空白对照组小鼠比较，模型组小鼠的OGTT、GSP、FBG、INS均显著增加（P＜0.01）；尿动力检测中，膀胱漏尿点压（BLPP）、排尿期的最大排尿压（MVP）、排尿率（EV）均显著下降（P＜0.05或P＜0.01），而膀胱最大容量（MBC）、膀胱顺应性（BC）以及残余尿量（PVR）均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；离体肌条检测中，肌条对α，β-meATP、Carbachol、Capsaicin、KCl诱发的逼尿肌条舒缩反应显著下降（P＜0.05或P＜0.01）。光镜观察HE染色切片，发现模型组小鼠的膀胱逼尿肌层束排列紊乱且间隙明显增宽，Masson染色切片发现胶原纤维成分下降。【结论】糖尿病小鼠膀胱的运动及感觉功能均出现功能障碍，并出现组织形态学变化，进入膀胱功能低下的失代偿期。

糖尿病膀胱；尿动力学；膀胱肌条；膀胱/病理学；疾病模型，动物；小鼠

糖尿病是当前威胁全球人类健康的最重要的非传染性疾病之一。糖尿病膀胱功能障碍（diabetic bladder dysfunction，DBD），又称为糖尿病性膀胱（diabetic cystopathy，DCP），是糖尿病最常见的泌尿系并发症之一，影响50%以上的糖尿病患者［1］。目前针对DBD的临床治疗手段虽然不少，但都是属于经验性治疗或对症治疗，常见的治疗方法有行为治疗、药物治疗、神经调节治疗等，严重者可采取手术治疗，如骨盆悬吊或膀胱颈悬吊，但疗效皆不尽如人意［2］。本研究对糖尿病膀胱功能障碍小鼠的膀胱功能及尿动力学进行观察，为探求有效的治疗方法、筛选中药活性成分及探讨其药理作用机制提供依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美国Sigma公司，批号：031M1287V）；辣椒素（Capsaicin，美国Cayman chemical公司，批号：0441703-13）；α，β-亚甲基-ATP（α，β-me ATP，美国Sigma公司，批号：SLBG3834V）；卡巴胆碱（Carbachol，山东博士伦福瑞达制药有限公司，批号：H10950174）；体积分数95%O2、5%CO2混合气体（广州君多气体有限公司，批号：A5A007）；氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、无水氯化钙（CaCl2）、无水硫酸镁（MgSO4）、硫酸二氢钾（KH2PO4）和无水葡萄糖（C6H12O6）均为天津市大茂化学试剂厂产品。高温灭菌柜（HVE-50，日本HIRAYAMA生产公司）；Laborie UDS-94型尿动力学检查仪（加拿大Laborie公司）；WZ-50C6型微量注射泵（浙江史密斯医学仪器有限公司产品）；生物机能记录系统（澳大利亚 AD Instruments Powerlab公司产品）；Multiskan Go 1510全波长酶标仪（美国Thermo scientific公司）。

1.2实验动物SPF级C57BL/6小鼠，雄性，体质量20～22 g，由广东省实验动物中心提供，合格证号为：SCXK（粤）2013-0002，在广州中医药大学实验动物中心饲养并完成实验。

1.3造模方法参考文献［3］方法，取以上C57BL/ 6小鼠30只，随机分为2组，即空白对照组、模型组。空白对照组给予普通饲料，模型组给予高糖高脂饲料，定量饮食，自由饮水。高糖高脂饲料造模4周后，动物禁食不禁水12 h，模型组动物按200 mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ（临用前用0.1 mmol/L，pH 4.4的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液配制成10 mg/L的STZ溶液，30 min内使用完），空白对照组腹腔注射等体积的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液。于STZ造模72 h后，动物禁食不禁水测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），FBG值到达10.5 mmol/L者视为造模成功，再连续喂养至12周，最后造模成功小鼠有8只。

1.4观察指标

1.4.1模型小鼠血糖、口服糖耐量、糖化血清蛋白及胰岛素的变化造模12周后，小鼠禁食不禁水8 h，于尾尖采血，用血糖试纸测定0 min血糖值；然后灌服500 mg/L葡萄糖溶液（剂量为1.5 g/ kg）；此后分别于15、30、60、120 min，尾尖采血，用血糖试纸测定血糖值，并计算血糖曲线下面积（AUC）；同时检测糖化血红蛋白及胰岛素含量。

1.4.2模型小鼠尿动力学的变化［4］造模成功12周后，小鼠以乌拉坦麻醉后，仰卧位固定。将静脉留置针从膀胱顶插入，小荷包缝合，经三通阀连接膀胱测压管和灌注管。排空动物膀胱尿液，膀胱测压管与压力传感器相连，灌注管与微量注射泵相连，泵水速度为50 μL/min。充盈期膀胱内压及漏尿点压测定：体内置零后开启微量注射泵向膀胱内灌注生理盐水，记录尿液自主溢出时的膀胱压，即为膀胱漏尿点压（bladder leak point pressures，BLPP），此时停止灌注，观察压力曲线，其峰值即为最大膀胱排尿压（maximum voiding pressure，MVP）。计算灌注时间×灌注速度，即膀胱最大容量（maximum bladder capacity，MBC）；用注射器经灌注管抽出膀胱内残余液体，其体积即为残余尿量（post void residual，PVR）；计算顺应性 BC （bladder compliance，BC=ΔV/ΔP，mL/mmH2O）、有效膀胱容量（Voiding Volume，Vv，Vv=MBCPVR）和排尿效率（efficiency of voiding，EV=Vv/ MBC×100%）。

1.4.3模型动物膀胱功能的变化进一步观察α，β-me ATP、Carbachol、Capsaicin、KCl诱发的逼尿肌条舒缩反应的影响，具体方法如下。造模成功12周后，处死小鼠，全切膀胱，立刻把膀胱放入盛有37℃Krebs营养液的平皿中，并持续通入体积分数95%O2、5%CO2混合气体，纵行切成8 mm×2 mm肌条，称取肌条质量后将肌条固定于恒温平滑肌槽内。上端连接张力传感器，可通过装置的微调螺旋调节肌条的牵拉程度。张力传感器与八通道多功能生理信号放大器相连，放大器连接生理信号收集系统，检测信号输入计算机。肌条静置于Krebs营养液中无张力适应30 min。待肌条稳定后，给予肌条0.5 g前负荷张力，维持60 min。肌条维持0.5 g前负荷张力稳定后，先后加入α，β-me ATP（100 μmol/L）、Carbachol（10-8～10-5mol/L）、辣椒素Capsaicin（10 μmol/L）、KCl（120 mmol/L），每种药物加入浴槽中，观察肌条收缩反应；然后冲洗3次，肌条平衡30 min后再进行下一药物实验。所测得的结果以每mg肌条所产生的张力［张力/肌条质量，w/（mg·mg-1）］表示。其中Carbachol各浓度加入后绘制累积浓度反应曲线（cumulative concentration-response curves，CRCs）。

1.4.4膀胱组织形态学观察大鼠处死后取出膀胱组织，以40 g/L多聚甲醛固定，无水乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，常规苏木素—伊红（HE）和Masson染色，光镜观察。

1.5统计方法采用SPSS 19.0统计软件，数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1模型组小鼠空腹血糖值和口服糖耐量的变化

表1结果显示：与空白对照组比较，造模后及造模12周后，模型组的空腹血糖（FBG）值均显著上升，差异均有统计学意义（P<0.01）。

如图1所示，与空白对照组比较，造模12周后，模型组口服葡萄糖耐量（OGTT）曲线下面积、糖化血清蛋白（GSP）和胰岛素（INS）水平均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表1　模型建立前后小鼠空腹血糖值的变化Table 1　Comparison of FBG levels of mice in various groups before and after modeling　［±s，c/（mmol·L-1）］

表1　模型建立前后小鼠空腹血糖值的变化Table 1　Comparison of FBG levels of mice in various groups before and after modeling　［±s，c/（mmol·L-1）］

①P＜0.01，与空白对照组比较

组别空白对照组模型组N 8 8造模前5.33±0.07 5.29±0.02造模后5.57±0.17 11.55±0.72①造模12周后6.05±0.53 13.64±4.40①

图1　各组口服糖耐量曲线下面积、糖化血清蛋白和胰岛素的变化比较Figure 1　Comparison of glucose tolerance（area under curve），glycated serum protein and insulin in the blank control group and model group　（±s，N=8）

2.2各组膀胱功能及容量的变化表2结果显示，模型组膀胱漏尿点压（BLPP）、排尿期的最大排尿压（MVP）和排尿率（EV）显著下降（P＜0.01），膀胱最大容量（MBC）、残余尿量（PVR）和膀胱顺应性（BC）显著上升，与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　糖尿病小鼠尿动力学的影响Table 2　Changes of urodynamics indexes in diabetic cystopathy mice　（±s）

表2　糖尿病小鼠尿动力学的影响Table 2　Changes of urodynamics indexes in diabetic cystopathy mice　（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，与空白对照组比较

组别空白对照组模型组组别空白对照组模型组N 8 8 N 8 8 pBLPP/mmH2O 26.22±1.09 15.64±0.22②pBC 0.00±0.000 1 0.013 3±0.000 8①pM VP/mmH2O 26.26±1.08 15.70±0.22②vPVR/mL 0.04±0.00 0.13±0.01②vMBC/mL 0.10±0.00 0.21±0.01②pEV/% 0.57±0.02 0.38±0.02②

2.3各组膀胱逼尿肌条对α，β-me ATP、Capsaicin、KCl、Carbachol诱发收缩反应的影响表3结果显示，各组离体肌条分别加入α，β-me ATP（100 μmol/L）、Capsaicin（10 μmol/L）、KCl （120 mmol/L）后，均产生收缩反应，模型组收缩幅度均显著小于空白对照组（P＜0.01）。

表3　逼尿肌条对α，β-me ATP、Capsaicin、KCl收缩反应比较Table 3　Effects of α，β-me ATP，Capsaicin，and KCl on contraction reactions of isolated bladder detrusor　［±s，w/（mg·mg-1）］

表3　逼尿肌条对α，β-me ATP、Capsaicin、KCl收缩反应比较Table 3　Effects of α，β-me ATP，Capsaicin，and KCl on contraction reactions of isolated bladder detrusor　［±s，w/（mg·mg-1）］

①P＜0.01，与空白对照组比较

组别空白对照组模型组N 8 8α，β-meATP 88.05±4.24 19.42±1.53①Capsaicin 2.46±0.07 0.81±0.04①KCl 102.75±9.25 63.38±4.75①

表4结果显示：各组肌条对Carbachol在3.0× 10-7～1.0×10-5mol/L刺激时，均产生收缩反应，在此浓度范围内，模型组收缩值较空白对照组显著下降（P＜0.01）。

2.4各组膀胱组织形态学结果如图2、图3所示，HE染色下，与空白对照组比较，模型组小鼠膀胱逼尿肌纤维排列杂乱，细胞间隙明显增大；Masson染色下可见模型组小鼠膀胱组织中的胶原纤维（蓝色部分）含量低于空白对照组，这些都属于典型的糖尿病神经源膀胱病理改变。

图2　各组膀胱组织形态学比较（HE染色，×100）Figure 2 Comparison of histomorphologic feature of bladder tissue in various groups（by HE staining，×100）

3　讨论

传统上，糖尿病膀胱的形成一度被认为仅仅是自主神经病变。当自主神经感受功能受损时，患者无法感受到膀胱充盈，缺乏排尿意愿，导致残留尿量增加，逼尿肌收缩力减弱，甚至于尿失禁。可是，这种传统观念显然无法解释糖尿病膀胱（DCP）复杂的临床表现，因为临床上也可以见到25%～55%糖尿病患者有逼尿肌过度活动。近年来越来越多的研究者们发现情况远比想像中复杂得多。DCP既有膀胱排空的问题，也有贮尿的问题［5-6］。而膀胱排尿和贮尿功能由复杂的神经网络支配，存在自主神经、肌层传入和传出神经的交互作用与影响，由逼尿肌的收缩和舒张实现，并有膀胱上皮感应器的参与。Daneshgari等［7］提出一个“时间框架”假说（temporal theory），试图从病理生理学角度统一认识。简单地说，就是糖尿病膀胱形成受多因素影响，在自然病史上可以分为2个阶段：早期阶段，糖尿病的渗透性多尿占主导地位，导致膀胱代偿性肥大，发生神经源性和肌源性病理改变，表现为高反应的膀胱，核心是贮尿问题；晚期阶段，持续高血糖所产生的氧化应激产物不断蓄积，损伤膀胱组织和功能，表现为无动力的、功能失代偿的膀胱，核心是排尿问题。

表4　不同浓度Carbachol诱发逼尿肌条收缩反应的影响Table 4　Effects of different concentrations of Carbachol on contraction reactions of isolated bladder detrusor ［±s，w/（mg·mg-1）］

表4　不同浓度Carbachol诱发逼尿肌条收缩反应的影响Table 4　Effects of different concentrations of Carbachol on contraction reactions of isolated bladder detrusor ［±s，w/（mg·mg-1）］

①P＜0.01，与空白对照组比较

图3　各组膀胱组织形态学比较（Masson染色，×100）Figure 3　Comparison of histomorphologic feature of bladder tissue in various groups （by Masson staining，×100）

通过尿动力学的改变，可以测知糖尿病膀胱所处的阶段和状态。本研究结果显示：造模后12周的糖尿病小鼠膀胱漏尿点压（BLPP）、排尿期的最大排尿压（MVP）和排尿率（EV）显著下降，相应的，膀胱最大容量（MBC）、残余尿量（PVR）和膀胱顺应性（BC）均显著上升，这说明此时膀胱动力不足、出现排尿问题，相当于糖尿病膀胱功能障碍的失代偿阶段。这种特征可能与膀胱感觉与运动功能的渐进性丧失有关，导致形成胀大的膀胱和尿量残留慢性化。多种糖尿病模型动物均发现类似的异常特征，如STZ诱导的糖尿病大鼠、糖尿病中国仓鼠，alloxan诱导糖尿病大鼠模型等［8］。

排尿过程由神经介导的逼尿肌收缩完成，其中主要递质有乙酰胆碱和ATP，研究发现平滑肌M3受体和P2X1受体均参与逼尿肌收缩反应［9］。有文献［10］报道，与正常的Wistar大鼠比较，2型糖尿病模型Goto-Kakizaki大鼠具有膀胱及下尿道的功能异常改变；虽然其离体膀胱平滑肌对Carbachol所致收缩的反应性下降，但对电场刺激（electric field stimulation，EFS）和高K+状态的反应性不变。

本研究结果显示：糖尿病C57BL/6小鼠的离体膀胱平滑肌对M3胆碱受体激动剂Carbachol和P2X1受体激动剂α，β-me ATP所致收缩的反应性均出现下降。结合病理形态学结果，糖尿病小鼠膀胱肌纤维减少，提示可能存在相应的M3受体和P2X1受体数量减少，从而导致平滑肌对激动剂收缩反应性下降。本研究还发现，糖尿病C57BL/6小鼠的离体膀胱平滑肌对非受体依赖的KCl收缩反应性亦出现下降。KCl可导致膜的去极化和增加钙内流，后者可激活收缩蛋白。这说明糖尿病小鼠膀胱逼尿肌收缩功能下降可能是多因素导致的。

瞬时受体电位通道（transient receptor potential channels，TRP channels）是位于细胞膜上的一类重要的阳离子通道，其中TRPV1在维持膀胱正常排尿功能的机械感觉中有重要作用，TRPV1通道可被辣椒素Capsaicin激活，继而通过中枢神经引起逼尿肌收缩［11］。本研究发现Capsaicin诱导的逼尿肌收缩反应亦出现下降。

综上所述，本研究从多角度观察糖尿病小鼠模型的膀胱尿动力学和病理学特征，可为筛选治疗糖尿病膀胱功能障碍的中药活性成分，研究其药理作用机制奠定基础。

［1］中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南（2013年版）［J］.中国糖尿病杂志，2014，22（8）：2.

［2］Golbidi S，Laher I.Bladder dysfunction in diabetes mellitus［J］. Front Pharmacol，2010，1（1）：136.

［3］Guilford B L，Ryals J M，Wright D E.Phenotypic changes in diabetic neuropathy induced by a high-fat diet in diabetic C57Bl/6 mice［J］.Exp Diabete Res，2011，2011：848307.

［4］赖焕玲，梁志健，吴清和，等.不同灌注速度及方法对大鼠膀胱容量、压力及神经传入电活动测定的影响［J］.中国病理生理杂志，2015，31（2）：379.

［5］Bansal R，Agarwal M M，Modi M，et al.Urodynamic profile of diabetic patients with lower urinary tract symptoms：association of diabetic cystopathy with autonomic and peripheral neuropathy［J］. Urology，2011，77：699.

［6］Gomez C S，Kanagarajah P，Gousse A E.Bladder dysfunction in patients with diabetes［J］.Curr Urol Rep，2011，12（6）：419.

［7］Daneshgari F，Liu G，Birder L，et al.Diabetic bladder dysfunction：current translational knowledge［J］.J Urol，2009，182（6 Suppl）：S18.

［8］Liu G，Daneshgari F.Diabetic bladder dysfunction［J］.Chin Med J （Engl），2014，127（7）：1357.

［9］Burnstock G.Purinergic signaling in the urinary tract in health and disease［J］.Purinergic Signal，2014，10（1）：103.

［10］Aizawa N，Homma Y，Igawa Y.Characteristics of lower urinary tract dysfunction and bladder afferent nerve properties in type 2 diabetic goto-kakizaki rats［J］.J Urol，2013，189（4）：1580.

［11］Li M，Sun Y，Simard J M，et al.Increased transient receptor potential vanilloid type 1（TRPV1）signaling in idiopathic overactive bladder urothelial cells［J］.Neurourol Urodyn，2011，30（4）：606.

【责任编辑：黄玲】

Changes of Bladder Function and Urodynamics of Diabetic Cystopathy Model Mice

TAN Bo，LIAN Dawei，HUANG Yongxin，FAN Pinglong，CAO Hongying，HUANG Ping
（Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

ObjectiveTo investigate the changes of urodynamics indexes and bladder function of diabetic cystopathy mice，thus to provide evidence for studying the therapeutic mechanism for active ingredients of Chinese medicine.Methods C57BL/6 male mice were randomly divided into blank control group and model group.The mice in the blank control group were given common fodder，and the mice in the model control group were given purified high fat fodder，lasting for 4 continuous weeks.The mice in the model group received intraperitoneal injection of 200 mg/kg of streptozocin，and when fasting blood glucose value arrived to 10.5 mmol/L，the mouse model of diabetic cystopathy was proved being successfully established.After the modeled mice were fed for another 12 weeks，we determined the levels of oral glucose tolerance testing（OGTT），glycated serum protein（GSP），fasting blood glucose（FBG）and insulin（INS）.We performed the urodynamic test，and measured the detrusor strip function with Powerlab biological signal system.And the histomorphology of bladder was observed under light microscope after hemotoxylin and eosin staining and Masson staining. Results Compared with the blank control group，the levels of OGTT，GSP，FBG and INS in the model group were increased（P＜0.01）.Urodynamic test results showed that bladder leak point pressure（BLPP），maximum voiding pressure（MVP）and efficiency of voiding（EV）were decreased（P＜0.05 or P＜0.01），while maximum bladder capacity（MBC），bladder compliance（BC）and post-void residual urine volume（PVR）were increased in the model group（P＜0.05 or P＜0.01）.The results of isolated bladder detrusor strip test showed that the contractility and relaxation reaction of bladder detrusor strip stimulated by α，β-meATP，Carbachol，Capsaicin，and KCl were lowered（P＜0.05 or P＜0.01）.And HE staining results showed that bladder detrusor had disordered myofilament and widened gap under optical microscope，and Masson staining results showed that the amount of collagenous fibers was decreased.Conclusion Diabetic cystopathy mice have motorand sensory dysfunction， and have abnormal histomorphology， indicating that the bladder has developed into the decompensated stage.

diabetic cystopathy；urine dynamics；detrusor strip；bladder/pathology；disease models，animal；mice

R587.2

A

1007-3213（2016）04-0573-06

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.030

2016-03-01

谈博（1974-），男，副教授；E-mail：tannyr@163.com

黄萍（1960-），女，教授；E-mail：hping331@126.com

国家自然科学基金资助项目（编号：81202982）；广州中医药大学薪火计划项目（编号：XH20140111）