冰香散挥发油黏膜免疫抗流感病毒效果评价

栗昀，　赖艳妮，　李向阳，　徐培平

（广州中医药大学，广东广州　510405）

冰香散挥发油黏膜免疫抗流感病毒效果评价

栗昀，赖艳妮，李向阳，徐培平

（广州中医药大学，广东广州510405）

【目的】评价冰香散挥发油抗流感病毒黏膜免疫的效果。【方法】将30只BABL/c小鼠分为正常对照组、安慰剂组、以及冰香散挥发油组，每组10只。提前7 d预防给药，正常对照组正常饲养，安慰剂组（体积分数为1%吐温-80）灌胃给药（1 mL/d），冰香散挥发油组滴鼻给药（0.05 mL/d），以5倍半数致死量（5LD50）流感病毒液A/FM/1/47（H1N1）滴鼻感染小鼠，建立病毒性肺炎小鼠模型。之后连续观察5 d，眼球摘除取血，收集鼻黏膜、支气管肺泡灌洗液，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测IgA、IgG、分泌型IgA（s-IgA）含量；分离鼻相关淋巴组织，采用免疫组织化学法测定CD4、CD8表达；收集脾淋巴细胞，以刀豆蛋白（ConA）和脂多糖（LPS）刺激，采用细胞增殖与活性试剂盒（CCK-8）检测脾淋巴细胞增殖情况；采用ELISA检测脾淋巴细胞分泌细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）水平。【结果】冰香散挥发油组能提高灌洗液s-IgA和血清IgA水平，提高血清IgG含量，刺激CD4+、CD8+T细胞分化与成熟，刺激脾淋巴细胞增殖，刺激细胞因子IFN-γ、IL-4分泌，与安慰剂组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。【结论】冰香散挥发油滴鼻免疫能够有效地诱导黏膜免疫反应，引起体液免疫和细胞免疫，发挥抗病毒作用。

冰香散挥发油；流感病毒；黏膜免疫；疾病模型，动物；小鼠

流感主要是由流感病毒引起的呼吸道传染病。近年来，由于流感病毒抗原的变异，出现高致病性的禽流感在人类的传播导致感染人数和死亡人数不断增多［1］。流感病毒通过飞沫传播，侵袭呼吸道黏膜。呼吸道黏膜免疫作为第一道免疫屏障在抵抗流感病毒感染的过程中发挥着重要的作用。病毒感染之初，黏膜上的病毒载量较低，在此阻断病毒的侵袭是抑制流感病毒复制的有效手段［2］。

传统中医药在预防流行病方面发挥着重要作用。藿香、冰片等药物广泛用于预防和治疗流行病［3］。本研究通过以冰香散挥发油滴鼻预防给药，检测流感病毒模型小鼠体内免疫水平，探讨冰香散挥发油抗流感病毒的免疫机制，现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物及病毒株40只SPF级BABL/c小鼠，雌性，体质量是13～15 g，购自广东省实验动物在中心，合格证号：SCXK（粤）20132-2014；流感病毒A/FM/1/47（H1N1）鼠肺适应株，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，经广州中医药大学热带医学研究所病毒实验室鸡胚扩种后于-80℃冷冻保存。

1.2药物以及试剂冰香散（冰片、广藿香等）购自广州中医药大学第一附属医院中药房，药物制剂以及提取参考文献［4］；利巴韦林（病毒唑）注射液购自辰欣药业股份有限公司，批号：H19993512；吐温-80购自天津大茂（批号：20120110）；小鼠分泌型免疫球蛋白A（s-IgA）酶联免疫试剂盒（批号：CSB-E08413m）、小鼠干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫试剂盒（批号：CSB-E08212）、小鼠白细胞介素-4（IL-4）酶联免疫试剂盒（批号：CSB-E08732）均购自美国Cusabio公司；淋巴细胞分离液（批号：DKW33-R0100）购自美国深圳达可为生物技术有限公司；小鼠免疫球蛋白G（IgG）酶联免疫试剂盒（批号：EK-271-20151224）购自联科生物公司；CD4抗体（批号：980809）、CD8抗体（批号：YE0381W）均购自北京博奥森生物技术有限公司；刀豆蛋白（ConA）和 脂多糖（LPS）均购自美国Sigma公司；胎牛血清（批号：120721）以及1640培养基（批号：131946）均购自美国Gibco公司；细胞增殖与活性试剂盒（CCK-8）（批号：GX609）购自碧云天公司。

1.4动物分组及给药将30只BABL/c小鼠随机分成3组，每组10只，分别为正常对照组、安慰剂组、冰香散挥发油组，按照本实验室建立的流感病毒感染模型方法进行造模［5］。提前7 d预防给药，安慰剂组灌胃给药（体积分数1%吐温-80—生理盐水）1 mL/d，冰香散挥发油组滴鼻给药（剂量为0.05 mL/d），正常对照组正常饲养。连续给药7 d后，乙醚轻度麻醉小鼠，以5倍半数致死量（5LD50）流感病毒50 μL滴鼻感染小鼠，连续观察5 d，处死小鼠，采集标本。

1.5血清lgA、IgG检测摘除眼球采血，收集血液，室温放置30 min以上，2 000 r/min，离心20 min，收集血清，-20℃保存。

1.6肺泡灌洗液以及鼻黏膜s-IgA检测处死小鼠，分离气管，用1 mL针管从气管上端向肺组织注射无菌生理盐水，回抽清洗液，每次2 mL，分2次冲洗。同法从气管向鼻部注射生理盐水，收集鼻黏膜冲洗液。

1.7鼻相关淋巴组织CD4、CD8表达常规分离鼻相关淋巴组织，采用免疫组织化学法检测。以体积分数10%甲醛固定至少24 h，脱水，石蜡包埋，脱蜡，抗原修复，内源性酶灭活；加入一抗、二抗，之后加入显色剂，判读，以积分光密度值（IOD）表示CD4、CD8的表达水平。

1.8脾细胞增殖实验无菌条件下摘取小鼠脾脏，在淋巴细胞分离液中，用灭菌的尼龙网碾磨脾脏，收集分离液，离心；收集淋巴细胞，96孔细胞培养板，用含有体积分数10%胎牛血清的1640培养基，每孔加入100 μL淋巴细胞悬液（5×106/mL），用10 μg/mL的ConA或者是 LPS刺激，在37℃、体积分数5%CO2的条件下培养淋巴细胞48 h，之后加入10 μL CCK-8培育4 h，在490 nm处测定吸光度。

1.9细胞因子IFN-γ、IL-4检测收集淋巴细胞，制成细胞悬液（5×106/mL），每孔加入100 μL，以10 μg/mL ConA刺激，培养48 h后，收集细胞上清，按照ELISA试剂盒的操作要求进行操作。

1.10统计方法用SPSS 17.0统计软件进行数据统计，计量资料以均数±标准差（±s）表示，进行多组数据计量资料单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组对IgA、IgG、s-IgA含量的影响表1结果显示：与安慰剂组比较，冰香散挥发油组能显著提高灌洗液s-IgA、血清IgA和IgG含量，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表1　冰香散挥发油对lgA、lgG、s-lgA含量的影响Table 1　Effects of Bingxiang San volatile oil on the contents of lgA，lgG and s-lgA　（±s）

表1　冰香散挥发油对lgA、lgG、s-lgA含量的影响Table 1　Effects of Bingxiang San volatile oil on the contents of lgA，lgG and s-lgA　（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，与安慰剂组比较

组别　N　ρs-lgA/（pg·mL-1）　ρ血清/（pg·mL-1）正常对照组安慰剂组冰香散挥发油组5 5 5支气管肺泡灌洗液-8.19±1.68 9.99±2.47①鼻黏膜冲洗液-0.33±0.1 0.55±0.38①lgA -1.74±0.42 2.45±0.66②lgG -13.2±3.6 19.6±3.3①

2.2各组对CD4+、CD8+细胞的影响图1结果显示：与正常对照组比较，冰香散挥发油组CD4+以及CD8+细胞数量明显增多。图2结果显示：安慰剂组CD4、CD8积分光密度值较正常对照组显著升高，冰香散挥发油组CD4、CD8积分光密度值较安慰剂组显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3各组对脾细胞增殖影响图3结果显示；经ConA和LPS刺激，冰香散挥发油组能显著增加脾细胞增殖，与安慰剂组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）

2.4各组对细胞因子IFN-γ、IL-4影响图4结果显示：安慰剂组可显著升高IFN-γ、IL-4的水平，与正常对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；冰香散挥发油组可显著升高IFN-γ、IL-4水平，与安慰剂组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

3　讨论

除细菌等少数病原体外，包括流感病毒在内的大部分病原体都是通过黏膜感染机体。呼吸道黏膜免疫作为第一道免疫屏障，在抵抗流感病毒感染的过程中发挥着重要的作用。s-IgA是呼吸道黏膜免疫防御的主要保护因子，在引起机体局部免疫和保护呼吸道消化道黏膜中发挥着重要作用［6］。其功能表现在通过与呼吸道中的病原体直接结合，能够有效地中和致病病原的毒力分子，阻碍病原体对黏膜表面的黏附，从而抑制其进入细胞内引发感染［7］。流感病毒虽为细胞内感染，但在流感病毒感染过程中所激发的体液免疫应答发挥着重要作用。黏膜表面的s-IgA主要作用在于抵抗上呼吸道感染，而血清中IgG主要在抵抗下呼吸道感染中发挥主要作用［8］。血清中的抗体可以中和病毒，清理细菌，激活补体的级联反应，限制病原体增至和扩散，防止组织损伤［9］。此外，黏膜分泌的s-IgA是具有交叉保护作用的抗体，它能对流感病毒的不同亚型具有中和作用［8］。在临床上，抗病毒药物很难持久运用的主要原因是因为病毒的耐药性。耐药毒株随着药物的使用会很快产生适应性，阻断病毒离子通道剂金刚烷胺和神经氨酸酶抑制剂奥司他韦均有耐药性的报道［10-11］。因此，能够刺激黏膜分泌大量的s-IgA 和IgG是评价抗病毒药物效果的重要指标。IgA分为血清型IgA和分泌型IgA（s-IgA），s-IgA分布在黏膜表面，而血清型IgA主要分布在血清中，其含量仅次于IgG，占血清免疫球蛋白含量的20%左右，占总IgA的85%左右，能够介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，发挥免疫功能［12］。

图1　冰香散挥发油对CD4+、CD8+细胞表达的影响（免疫组织化学法，×20）Figure 1　Effects of Bingxiang San volatile oil on the expression of CD4+and CD8+cells（by immunohistochemistry，×20）

图2　各组CD4、CD8积分光密度值比较Figure 2　Comparison of integral optical density of CD4 and CD8 in various groups　（±s，n=5）

图3　冰香散挥发油对脾细胞增殖影响Figure 3 Effects of Bingxiang San volatile oil on the proliferation of splenic lymphocytes　（±s，n=5）

脾脏是淋巴细胞（T细胞和B细胞）的定居场所。T细胞介导的细胞免疫和B细胞介导的体液免疫相辅相成，在抗击流感病毒方面发挥着重要免疫调节作用［14］。鼻黏膜相关淋巴组织是流感病毒接触以及感染的第一道防线，激活鼻黏膜相关淋巴组织对于防御和抵抗流感病毒的感染具有重要意义［14］。流感病毒进入机体，被游离的未成熟的树突状细胞识别，促进树突状细胞成熟，进而抗原被成熟的树突状细胞摄取，递呈给T细胞和B细胞，激活T、B淋巴细胞，进而发生不同的免疫反应。激活的B细胞分化成为主要分泌抗体的浆细胞，引起体液免疫。T细胞主要分为CD4+T细胞和CD8+T细胞（细胞毒性T淋巴细胞），两者在控制病毒感染，减轻病变程度和死亡率方面发挥着重要作用［15］。CD4+T细胞分为Th1和Th2、Th17等亚型。其中，Th1产生细胞因子（IL-2，TNF-α，IFN-γ）能够促进细胞免疫，Th2产生的细胞因子（IL-4，IL-5 和IL-10）介导体液免疫应答和抗体亚单位的转换［16］。细胞因子是评价免疫效果的重要的指标，作为免疫系统细胞之间的信使，在调节免疫反应、清除病原体方面发挥着重要作用［17］。

图4　冰香散挥发油对细胞因子IFN-γ、IL-4影响Figure 4 Effects of Bingxiang San volatile oil on IFN-γ and IL-4 levels　（±s，n=5）

冰香散挥发油滴鼻给药，能够有效地诱导黏膜免疫反应，产生大量的具有交叉保护作用的s-IgA抗体；能够刺激感染小鼠脾淋巴细胞大量增殖，促进T细胞和B细胞活化，产生细胞免疫和体液免疫，促进具有抗病毒作用的细胞因子IFN-γ和IL-4分泌。安慰剂组中CD4和CD8表达升高，细胞因子IFN-γ和IL-4分泌增多，可能与给药方式有关，滴鼻给药后，药物刺激鼻黏膜，也可能引起黏膜免疫反应，表现出与实验组相似的结果。以上实验结果表明，冰香散挥发油滴鼻免疫具有较好的抗病毒作用，但有关黏膜免疫的机制需进一步研究。

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【责任编辑：黄玲】

Anti-influenza Virus Effects of Bingxiang San Volatile Oil Through Mucosal Immunity

LI Yun，LAI Yanni，LI Xiangyang，XU Peiping
（Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China）

ObjectiveTo evaluate the anti-influenza virus effects of volatile oil from Bingxiang San through inducing mucosal immunity.Methods Thirty BABL/c mice were randomly divided into normal control group （receiving normal feeding），placebo group（treated with Tween-80 at volume fraction of 1%），and BingxiangSan volatile oil group（intranasal treatment with 0.05 mL/d of Bingxiang San volatile oil），10 mice in each group. BALB/c mice were pre-treated with the corresponding medicine according to the grouping for 7 days before modeling.Mice were given nasal dripping of 5-fold LD50of A/FM/1/47（H1N1）fluids to induce viral pneumonia model.General condition of mice was observed for 5 continuous days.Contents of IgA and IgG in the blood and s-lgA in nasal mucosa and bronchoalveolar lavage fluids（BALF）were determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.CD4 and CD8 expression in nasal associated lymphoid tissue were determined by immunocytochemistry.Proliferation of concanavalin（ConA）-and lipopolysaccharide（LPS）-induced splenic lymphocytes was observed by cell proliferation and activity kit（CCK-8）.Cytokines of interferon gamma（INF-γ）and interleukin 4（IL-4）secreted from splenic lymphocytes were determined by enzyme-linked immuno-sorbenet assay（ELISA）.Results Bingxiang San volatile oil increased BALF and serum S-lgA level and serumlgG content（P＜0.05），promoted the differentiation and maturation of CD4+and CD8+T cells，enhanced the proliferation of splenic lymphocytes，and stimulated the secretion of cytokines IFN-γ and IL-4（P＜0.05 or P＜0.01 as compared with those of the placebo group）.Conclusion Bingxiang San volatile oil can effectively induce mucosal humoral and cellular responses to exert antivirus activity.

Bingxiang San volatile oil；influenza virus；mucosal immunity；disease models，animal；mice

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0535-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.022

2016-03-01

栗昀（1989-），女，硕士研究生；E-mail：857401521@qq.com

国家自然科学基金项目（编号：81072948，81470186）；广东省自然科学基金研究团队项目（编号：S2012003000698）