β-榄香烯干预人肝细胞癌HepG2细胞蛋白质组学研究

张义敏，　李萍，　田明涛，　唐承

（1.山东中医药大学，山东济南　250355；2.威海市胸科医院，山东威海　264200）

β-榄香烯干预人肝细胞癌HepG2细胞蛋白质组学研究

张义敏1，2，李萍2，田明涛2，唐承2

（1.山东中医药大学，山东济南250355；2.威海市胸科医院，山东威海264200）

【目的】通过观察不同浓度β-榄香烯作用于体外培养人肝细胞癌HepG2细胞的产生的差异性蛋白质表达，筛选β-榄香烯防治肝癌的作用靶点。【方法】于体外常规条件下，以0、10、30 μg/mL β-榄香烯培养基孵育人肝细胞癌HepG2 24 h，提取蛋白质后采用十二烷基硫酰钠—聚丙烯酸胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）分离蛋白，选取表达量升高或降低3倍以上的蛋白质点进行质谱鉴定，随后运用Protein Chip PBS1j-C型蛋白质芯片阅读仪将其检测绘制成蛋白质质谱。使用GPS Explore V 3.6软件对所有蛋白质质谱进行分析，并通过MASCOT V 2.1搜库软件进行检索，以鉴定蛋白质质点。【结果】通过对β-榄香烯处理前后肝癌HepG2细胞蛋白双向凝胶电泳图谱分析，共得到91个差异蛋白质点。选择表达量差异明显的53个蛋白质点进行质谱分析，得到具有统计学意义的差异蛋白质点9个，其中表达上调3个，分别是UBE2V1、SF1、Annexin V；表达下调6个，分别是β-Actin、S100A6、HSP70、Keratin4、FUBP1、Keratin18。【结论】β-榄香烯可影响人肝细胞癌HepG2细胞的蛋白质表达，这些蛋白质可能是β-榄香烯防治肝癌的作用靶点。

β-榄香烯；肝癌；蛋白质组学；HepG2

原发性肝癌是严重危害人类生命健康的重大疾病之一。目前原发性肝癌的治疗以手术为主［1］，但对于特殊部位或者晚期患者，仍缺乏有效的治疗手段。近年来，研究者们从中国传统中药中发现了一些具有抗肿瘤活性的有效成分，中药有效成分抗肿瘤研究已成为国内外研究的热点［2］。

莪术是我国姜科植物蓬莪术、广西莪术或温郁金的干燥根茎，是常用的活血化瘀药物，具有行气破血、消积止痛的功效，可用于治疗癥瘕痞块、瘀血经闭、胸痹心痛、食积胀痛［3］。现代药理研究［4］证实，莪术具有很好的抗肿瘤作用。β-榄香烯（β-elemene）是温莪术根茎提取物，是一种只含碳、氢2种元素组成的倍半萜烯类化合物，临床上为治疗恶性浆膜腔积液、肺癌、消化道肿瘤、脑瘤以及其他浅表性肿瘤的潜在新药，具有很强的杀灭肿瘤细胞及抑制肿瘤生长作用［5］。既往研究［6］发现，β-榄香烯具有抑制体外培养的人肝细胞癌HepG2细胞增殖的作用，但是其作用机制尚未见报道。因此，本研究通过观察β-榄香烯对体外培养人肝细胞癌HepG2细胞的蛋白质表达的影响，筛选β-榄香烯防治肝癌的作用靶点，以期阐明β-榄香烯防治肝癌的作用机制，现报道如下。

1　材料和方法

1.1试剂与仪器人肝细胞癌HepG2细胞购自中国科学院上海生化所细胞库；RPMI-1640培养基与胎牛血清均购自美国GibcoBrl公司；β-榄香烯购自中国药品生物制品检定所（批号：100268-200401，纯度≥98%）。三羟甲基氨基甲烷（Tris）、二硫苏糖醇（DTT）、十二烷基硫酸钠（SDS）、Nuclease Mix购自美国 Sigma公司；固相 pH梯度干胶条（IPGstrip pH=3～10NL，L=13 cm）、immobilized pHgradient（IPG）缓冲液（Ph3～10NL）、覆盖液、蛋白银染试剂盒均由美国GE公司生产；四甲基乙二磺（Temed）、3-［（3-胆酰胺丙基）-二乙胺］-丙磺酸（CHAPS）、Electrophoresis Regent（T9281）购自美国Simga公司。IPGphor等电聚焦仪由Pharmacia公司生产；ImageMaster2D platinum凝胶成像系统、ImageScannerⅢ扫描仪、PDQest 7.4分析软件、EXQuest全自动酶切系统、MODEL 680 Microplate Reader酶标仪均购自美国 Bio-Rad公司；MALDI-TOF/TOF基质辅助激光解吸串联飞行时间质谱仪购自美国应用生物系统公司；Image Master 6.0双向凝胶图谱分析软件购自美国GE公司。Mascot Distiller质谱信号峰识别软件、Mascot肽质量指纹图数据库查询软件及Mascot数据库查询软件购自美国Matrix science公司。所有溶液均用Milli Q水（美国Milli-pore公司产品）制备。

1.2细胞培养于37℃、体积分数5%CO2条件下，在饱和湿度无菌培养箱中使用含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养人肝细胞癌HepG2；当HepG2细胞生长至融合90%左右时，以2.5 g/L的胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3实验分组根据本研究前期研究结果，β-榄香烯对HepG2细胞24 h的半数致死量（IC50）为23.5 μg/mL，故本研究分为3组，即A组（空白对照组）：含（体积分数，下同）10%胎牛血清RPMI-1640培养基培养；B组：含10%胎牛血清+10 μg/mL β-榄香烯的RPMI-1640培养基组；C组：含10%胎牛血清+30 μg/mL β-榄香烯的RPMI-1640培养基组。3组细胞均于37℃、体积分数5%CO2条件下在饱和湿度无菌培养箱中孵育24 h，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。

1.4蛋白提取将各组细胞弃去培养瓶内上清液，采用细胞收集器收集生长至80%融合的细胞，用预冷的D-Hanks洗3次，300×g离心5 min；弃上清液后加入细胞裂解液，冰浴30min，16000×g，4℃离心5 min；弃细胞残屑，上清液即为细胞蛋白提取物。采用Bradford法［7］测定蛋白质浓度，以胎牛血清白蛋白（BSA）作标准曲线。

1.5双向凝胶电泳参考IPGphor等电聚焦系统指南的方法进行双向凝胶电泳，细胞蛋白上样量为500 μg，IPG干胶条水化与等电聚焦均在20℃的条件下开展。第一向等电聚焦（IEF）结束后经过平衡再进行第二向垂直板十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。停止电泳后，取出双向凝胶（2-DE）进行银染色［8］。然后采用Image Master 2D platinum凝胶成像系统扫描银染显色的凝胶，PDQuest 7.4图像分析软件对图像进行强度校正、过滤、拟合、点检测、背景消减、均一化和匹配等分析。

1.6酶解与质谱鉴定选取染色后具有显著差异的蛋白质点，进行脱色、酶解、萃取等，取上清液用ZIPTIPTMC18微柱进行脱盐；然后与5 mg/mL α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）基质液混合，在384孔不锈钢板上，取0.4 μL样品点于点样钢板上；然后取0.4 μL5 mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸二乙胺盐（CHCA）基质溶液于样品点上，自然风干以后进行质谱鉴定。用MALDI-TOF/TOF仪进行分析，取Nd：YAG激光器（355 nm波长），采用正离子和自动获取数据模式采集数据。获得的一级和二级质谱数据使用GPS Explore V 3.6软件进行分析，分析后的每一个样品的一级和二级质谱数据再整合成一个文件，使用MASCOT V 2.1搜库软件对本地数据库进行检索，鉴定蛋白质；数据库为IPI HumandatabaseV3.36， 物 种 为Homo sapiens （human），切割的酶为trypsin，允许最大的未被酶切位点数为1，可变修饰为半胱氨酸乙酰胺化和甲硫氨酸氧化。母离子质量容差为30～60 ppm，片段离子质量容差为0.2～0.3 Da。蛋白质的鉴定和质谱评分结果，及肽段匹配信息分析等均以MASCOT为搜索引擎在NCBInr数据库搜索。

2　结果

2.1不同浓度的β-榄香烯作用于HepG2细胞后的2-DE电泳图图1结果显示：以0、10、30 μg/mL 的β-榄香烯处理肝癌HepG2细胞24 h，提取蛋白，进行蛋白双向凝胶电泳图谱分析后，分别将10 μg/mL组、30 μg/mL组与空白对照组（0 μg/mL组）比较；将30 μg/mL组与10 μg/mL组比较，共得到91个差异蛋白质点；选取其中表达差异率3倍以上的蛋白质点作为差异点，共53个蛋白质点进行质谱分析；最终得到有意义的差异蛋白质点9个。

2.2质谱鉴定结果表1结果显示的是所得到的9个有意义差异蛋白质经过NCBInr数据库检索之后的名称、理论分子量、等电点等属性。这9个蛋白质为分别是β肌动蛋白（β-Actin）、泛素结合酶E2变异体1（UBE2V1）、重组人S100钙结合蛋白A6（S100A6）、热休克蛋白70（HSP70）、角蛋白4（Keratin4）、膜联蛋白V（Annexin V）、剪接因子1（SF1）、角蛋白18（Keratin18）、DNA远端上游元件结合蛋白1（FUBP1）。其中 UBE2V1、S100A6、HSP70为30 μg/mL组与10 μg/mL组比较得到的差异蛋白质点，SF1、FUBP1、Keratin4、Annexin V为30 μg/mL组与空白对照组比较得到的差异蛋白质点，β-Actin和Keratin18为10 μg/mL与空白对照组比较得到的差异蛋白质点。随着β-榄香烯浓度升高表达上调的3个蛋白质，分别是UBE2V1、SF1、Annexin V；随着β-榄香烯浓度升高表达下调的 6个蛋白质，分别是 β-Actin、S100A6、HSP70、Keratin4、FUBP1、Keratin18。

图1　不同浓度的β-榄香烯作用于HepG2细胞后的2-DE电泳图Figure 1 Two-dimensional gel electrophoresis results for the effect of different concentrations of β-elemene on HepG2

表1　β-榄香烯处理前后HepG2细胞差异蛋白质表达Table 1　Differential-protein expression in HepG2 before and after treatment with β-elemene

3　讨论

本研究发现β-榄香烯能够调节多种蛋白质的表达，这些差异蛋白表达不仅验证了体外细胞培养的研究结果，而且预测了可能存在的抗肝癌的作用机制。以下对所得到的9个蛋白质进行简要讨论。

UBE2V1对核转录因子（NK-κB）信号传导通路的活化调控至关重要，能够介导NK-κB靶基因的转录激活，在细胞凋亡、生长抑制、抑制细胞周期和分化进程及DNA修复过程中具有重要作用，有助于细胞DNA损伤后的修复［9-10］。本研究中β-榄香烯可以上调UBE2V1的表达，从而使NK-κB转录活性增强，阻止肿瘤细胞的进一步增殖，并能诱导正常细胞的修复。

SF1是参与RNA前体剪接过程的蛋白质因子，可以通过抑制剪接因子，达到抑制剪接反应、阻碍RNA的成熟以及影响细胞代谢及生长的目的，这可能是肿瘤治疗的一个新的方向［11］。本研究结果表明：β-榄香烯能够上调SF1表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，从而发挥抗肿瘤的作用。

近年来的研究发现，Annexin V是一种人内源性蛋白，能与凋亡细胞表面的磷酯酰丝氨酸（PS）特异性结合，具有抗凝、抗炎作用，还具有抑制肿瘤血管新生和肿瘤生长的作用［12］。本研究结果表明：β-榄香烯可上调Annexin V表达，达到抑制肿瘤血管新生的作用。

β-Actin是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分，它在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用［13］。在本研究中，β-Actin是β-榄香烯作用于HepG2细胞的靶向蛋白之一。

S100A6是S100钙结合蛋白家族的重要成员，在多种肿瘤组织中均有表达增高现象，其异常表达与细胞的增殖、分化以及侵袭、转移关系密切［14］，因此是生物治疗及危险性预测的靶分子［15］。本研究结果显示：β-榄香烯能够抑制S100A6的表达。

HSP70是热休克蛋白家族中最重要、最保守的成员，细胞应激后其反应最明显，其在多种肿瘤细胞中呈现出高表达，与大部分肿瘤细胞低分化、淋巴结转移、肿瘤细胞耐药等方面关系密切［16］。韩大跃等［17］研究表明，榄香烯对肝癌细胞的生长有明显抑制作用，并诱导产生细胞凋亡。本研究中，β-榄香烯具有下调HSP70表达的作用，提示β-榄香烯可能通过抑制肝癌HepG2细胞中HSP70高表达，进而诱导肝癌细胞凋亡。

FUBP1与细胞增殖及细胞凋亡相关因子关系密切，是影响多种肿瘤发生和进展的重要肿瘤蛋白，其作为远端上游元件的结合因子，参与对原癌基因c-myc表达的调节［18］。Rabenhorst等［19］发现肝癌细胞的生长必须依赖FUBP1的过表达。本研究结果显示：通过β-榄香烯具有下调FUBP1表达的作用，可能是肝癌细胞恶性增殖的原因之一。

Keratin4、Keratin18均属于细胞角蛋白家族，是上皮细胞骨架成分，其在非单层上皮性肿瘤的分化和发展过程中异常表达，可增加肿瘤细胞的迁移性和浸润性［20］。Keratin已成为肝癌、胃癌等多种肿瘤诊断、分期和药效评价的重要指标［21］。本研究中，β-榄香烯可以下调Keratin4、Keratin18表达，提示β-榄香烯可能通过下调Keratin4、Keratin18表达抑制肿瘤转移。

总之，本研究利用蛋白质组学方法研究β-榄香烯干预肝癌HepG2细胞增殖的蛋白质分子基础，结果提示β-榄香烯可以影响肝癌细胞多种蛋白质表达，这些差异表达蛋白可能是β-榄香烯抑制肝细胞癌的作用机制。但是，本研究仅为体外细胞研究，结果有一定的局限性，仍需进一步探讨更为确切的作用机制。

［1］赵建夫，徐萌.CIK细胞免疫联合TACE微创治疗原发性肝癌的研究进展［J］.中国病理生理杂志，2015，31（7）：1334.

［2］贵志芳，任军，许健.MicroRNA介导中药活性成份抗肿瘤机制的研究进展［J］.生命科学，2014，26（11）：1215.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：74-275.

［4］李宝石，夏宁俊，朱超林.中药莪术对肿瘤相关信号通路影响研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2015，17（2）：188.

［5］徐莉英，张兴忠，杜惠莲，等.β-榄香烯氨基酸衍生物的合成及抗肿瘤活性［J］.中国药物化学杂志，2013，23（3）：169.

［6］Ding X F，Shen M，Xu L Y，et al.13，14-bis（cis-3，5-dimethyl-1-piperazinyl）-beta-elemene，a novel β-elemene derivative，shows potent antitumor activities via inhibition of mTOR in human breast cancer cells［J］.Oncol Lett，2013，5（5）：1554.

［7］Braddford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72：248.

［8］郭尧君.蛋白质电泳实验技术［M］.北京：科学技术出版社，2005：107.

［9］曹传辉，梁基韵，孙景苑.泛素结合酶E2T在消化系统肿瘤中的表达［J］.广东医学，2014，35（5）：687.

［10］Ueki T，Park J H，Nishidate T，et al.Ubiquitination and downregulation of BRCA1by ubiquitin-conjugating enzyme E2T overexpression in human breast cancer cells［J］.Cancer Res，2009，69（22）：8752.

［11］魏官云，邢永强，蔡禄.人类转录因子与剪接因子互作网络的构建与分析［J］.生物物理学报，2014，30（4）：238.

［12］Al-Nedawi K，Meehan B，Kerbel R S，et al.Endothelial expression of autocrine VEGF upon the uptake of tumor-derived microvesicles containing oncogenic EGFR［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（10）：3794.

［13］Moheimani F，Roth H M，Cross J，et al.Disruption of β-Catenin/CBP signaling inhibits humanairway epithelialmesenchymal transition and repair［J］.Int J Biochem Cell Biol，2015，68：59.

［14］Liu Z Q，Zhang X L，Chen M H，et al.Effect of S100A6 over-expression on β-catenin in endometriosis［J］.J Obstet Gynaecol Res，2015，29（4）：1.

［15］Nan Y，Jin F，Yang S，et al.Discovery of a set of biomarkers of human lung adenocarcinoma through cell-map proteomics and bioinformatics［J］.Med Oncol，2010，27（4）：1398.

［16］Danish M，Fatima A，Khanam S，et al.Evaluation of the toxic potential of calcium carbide in the third instar larvae of transgenic Drosophilamelanogaster（hsp70-lacZ）Bg9［J］.Chemosphere，2015，139（18）：469.

［17］韩大跃，张晨.热疗联合榄香烯对SMMC 7721肝癌细胞HSP70的影响［J］.临床军医杂志，2015，43（10）：1034.

［18］MiroJ，Laaref A M，Rofidal V，et al.FUBP1：a new protagonist in splicing regulation of the DMD gene［J］.Nucleic Acids Res，2015，43（4）：2378.

［19］Rabenhorst U，Beinoraviciute-Kellner R，Brezniceanu M L，et al.Overexpression of the far Upstream element binding protein 1 in hepatocellular carcinoma is required for tumor crowth ［J］.Hepatology，2009，50（4）：1121.

［20］Sundaresan R，Samen U，Ponnuraj K.Structure of KRT4 binding domain of Srr-1 from Streptococcus agalactiae reveals a novel β-sheet complementation［J］.Int J Biol Macromol，2015，75（4）：97.

［21］Wang X，Lao Y，Xu N，et al.Oblongifolin C inhibits metastasis by up-regulating keratin 18 and tubulins［J］.Sci Rep，2015，5：10293.

【责任编辑：黄玲】

Proteomics Research of Intervention Effect of β-elemene on Human Hepatocellular Carcinoma HepG2 Cells

ZHANG Yimin1，2，LI Ping2，TIAN Mingtao2，TANG Cheng2
（1.ShandongUniversityof Traditional ChineseMedicine，Jinan250355Shandong，China；2.Weihai Chest Hospital，Weihai264200Shandong，China）

ObjectiveTo screen the targets of β-elemene in preventing and treating hepatocellular carcinoma through observing differential protein expression of hepatocellular carcinoma HepG2 cells after intervention with different concentrations of β-elemene.Methods After intervention with culture medium containing 0，10，30 μg/mL of β-elemene for 24h，proteins of HepG2 cells were extracted and isolated with two-dimensional sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）method.The protein spots having the expression amount increasing or decreasing by more than 3 times were selected for mass spectrum identification，and then Protein Chip PBS1j-Ctype protein chip reader was used to detect and map the mass spectrogram of the proteins.After all the protein mass spectra were analyzed with Explore V3.6 GPS software，and the protein spots were identified through retrieving the local database with MASCOT V2.1 search software.Results The results of SDS-PAGE showed that 91 differential-protein spots were obtained after analyzing the electrophoresis map.After mass spectrum identification of 53 protein spots with obviously differential expression，we obtained 9 protein spots having statistical significance in protein differential expression.Ofthe 9 protein spots，up-regulated expression was shown in 3 protein spots，and theywere UBE2V1，Splicing Factor1，and FUBP1；down-regulated expression was shown in 6 protein spots，and they were β-Actin，S100A6，HSP70，Keratin4，Annexin V，and Keratin18.Conclusion β-elemene has an intervention effect on protein expression of hepatocellular carcinoma HepG2 cells，and the protein spots having statistical significance in protein differential expression probably are the target points.

β-elemene；hepatocellular carcinoma；proteomics；hepatocellular carcinoma（HepG2）

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0565-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.028

2015-12-18

张义敏（1981-），女，在读博士研究生，主治医师；E-mail：zhangyiminzym@hotmail.com

唐承，男，主治医师；E-mail：tangcheng968@126.com