益气除痰方对弥漫大B细胞淋巴瘤增殖及AKT表达的影响

翟林柱，　陈昌明，　赵媛媛，　林丽珠

（1.广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心，广东广州　510405；2.中山大学肿瘤防治中心内科，广东广州　510060）

益气除痰方对弥漫大B细胞淋巴瘤增殖及AKT表达的影响

翟林柱1，陈昌明1，赵媛媛2，林丽珠1

（1.广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心，广东广州510405；2.中山大学肿瘤防治中心内科，广东广州510060）

【目的】研究益气除痰方对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-ly10细胞增殖的影响及其作用机制。【方法】应用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法检测益气除痰方对OCI-ly10细胞的生长抑制作用，以流式细胞术细胞膜磷脂酰丝氨酸异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）染色检测联合应用益气除痰方和阿霉素诱导OCI-ly10细胞凋亡的能力。以Western blot法检测益气除痰方对OCI-ly10细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）及磷酸化AKT（Thr308、Ser473）表达的影响。【结果】益气除痰方含药血清对OCI-ly10细胞具有生长抑制作用，且具有一定的时间—浓度依赖性。流式细胞术检测中，联合应用益气除痰方含药血清和阿霉素组的凋亡率、阿霉素单药组凋亡率及含药血清组凋亡率均较阴性对照组显著升高，其中联合组促进肿瘤细胞凋亡的作用显著强于阿霉素单药组及含药血清组（均P＜0.05）。Western blot结果显示益气除痰方含药血清可显著降低总AKT和p-AKT（Thr308）的表达。【结论】益气除痰方对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-ly10细胞具有生长抑制及促进凋亡的作用，并对阿霉素具有一定的抗肿瘤增效作用，其作用机制可能与抑制了AKT磷酸化的信号通路相关。

益气除痰方；弥漫大B细胞淋巴瘤/中西医结合疗法；细胞凋亡；AKT；蛋白表达；细胞培养

弥漫大 B细胞淋巴瘤（diffused large B-cell lymphoma，DLBCL）是一种具有高度侵袭性的淋巴瘤，是成人非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）中最常见的亚型，约占所有NHL的30%～40%［1］。近年来，随着对该病认识的逐渐深入，包括靶向治疗、化疗以及放疗等现代医学治疗手段的联合应用可以使部分患者得到治愈，但仍然有40% ～50%的患者最终因肿瘤进展而死亡［1］。因此，如何进一步提高非霍奇金淋巴瘤尤其是DLBCL的治疗效果，成为目前亟待解决的临床难题。

益气除痰方是本院肿瘤科所创立的治癌良方，可以延长中晚期非小细胞肺癌的生存期，患者可以保持较高的生活质量，并且与化疗联合应用有协同作用［2］。根据“异病同治”的中医辨证原则，本课题组在运用益气除痰方治疗NHL尤其是DLBCL上也已经积累了丰富的经验［3］。研究发现益气除痰方与化疗联合使用，以及在化疗结束后用于维持治疗可以延迟部分患者的复发时间，已有成功治疗的患者长期生存［3］。但该方抑制DLBCL细胞的机制尚不明确，本研究拟通过观察益气除痰方作用下DLBCL细胞的生长规律，从体外水平探讨益气除痰方抑制DLBCL的分子机制，为益气除痰方在淋巴瘤治疗中的应用提供理论依据，现报道如下。

1　材料与方法

1.1细胞株人DLBCL淋巴瘤细胞株OCI-ly10细胞由南方医科大学南方医院惠赠。

1.2实验动物SPF级SD大鼠20只，体质量150～220 g，均为雌性，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（粤）2013-0006。

1.3主要试剂及仪器益气除痰方所用中药和阿霉素注射液（批号：H44024360）均购自广州中医药大学第一附属医院。鼠抗人磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶p-AKT（Thr308）一抗、鼠抗人P-AKT （Ser473）一抗、兔抗人AKT一抗均购自美国Cell Signaling公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠及羊抗兔二抗购自博奥森公司；体积分数10%胎牛血清（FBS）购自美国HyCLone公司；改进杜氏培养基IMDM购自美国Gibco公司；酶标仪（赛默飞世尔仪器有限公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；垂直、转移电泳槽及电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.4抗癌中药制备及中药血清制备

1.4.1中药制备益气除痰方由西洋参15 g、生半夏及山慈菇各15 g等组成，实验中所用汤剂处方中的药材，选用中国药典2005年版（一部）收载品种，中药饮片由专家鉴定。中药用纯化水煎煮3次，其中生半夏首次先煎30 min，纯化水用量分别为饮片的10倍、8倍、8倍量，时间各30 min，收集煎煮液，过滤，浓缩至含生药量2 g/mL，密闭4℃保存备用。

1.4.2含药血清制备SPF级SD大鼠20只，随机分成2组，即益气除痰方组（10只）及生理盐水对照组（10只）。益气除痰方组按Meeh-Rubner氏公式给予 10倍等效剂量的药物，每日2次，间隔8 h，连续5 d；第5天上午灌胃2次，间隔1 h于末次灌胃后1 h腹主动脉取血，室温下静置2～3 h后离心 15 min，取上清；56℃水浴箱灭活，0.22 μm滤膜过滤灭菌，分装后置于-20℃冰箱保存备用。

1.5细胞培养OCI-ly10细胞维持于含体积分数10%FBS的IMDM培养基中，于体积分数5%CO2、37℃下体外常规培养。

1.6CCK-8（Cell Counting Kit-8）法检测益气除痰方抑制肿瘤细胞生长培养液稀释单细胞悬液，以约2 000个/孔细胞接种至96孔培养板。培养24 h后，在细胞处于对数生长期时，分别加入阴性对照组（空白血清，A1组）、10%含药血清（体积分数，下同，A2组）、20%含药血清（A3组）、30%含药血清（A4组）、40%含药血清（A5组），50%含药血清（A6组），各组分别设3个复孔，置于培养箱中继续培养24、48、72、96 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37℃温育4 h后，以酶标仪450 nm单波长测定各孔吸光度（D）值，并记录结果。重复实验3次，取平均值。

1.7流式细胞术检测细胞凋亡率取对数生长期OCI-ly10细胞，接种至24孔培养板，培养24 h后，分别加入30%含药血清+0.1 μg/mL阿霉素（联合组，A组）、0.1 μg/mL阿霉素（阿霉素组，B组）、30%含药血清（含药血清组，C组）以及空白试剂（阴性对照组）。置于培养箱中继续培养48 h后，收集细胞。用冰PBS洗涤2次细胞，2 000 r/min离心 5 min，弃上清。加入 500 μL的 Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL Annexin V异硫氰酸荧光素（FITC）混匀后，加入碘化丙啶（PI）混匀。加入流式分析管中。室温、闭光，反应5～15 min。流式细胞仪检测的激发波长488 nm，Annexin V及PI的发射波长分别为525 nm和610 nm，每个样品测定20 000个细胞，以CXP Analysis软件分析细胞凋亡率。

1.8细胞总蛋白的提取和定量

1.8.1蛋白提取对照组和试验组分别用含30%大鼠空白血清的培养液和30%大鼠含药血清的培养液作用48 h后，采用放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解液抽提的细胞总蛋白，具体步骤如下：细胞裂解液100 μL加入悬浮细胞团，冰浴15 min，4℃、14 000 r/min离心10 min，收集上清液，即为总蛋白，-80℃保存。

1.8.2蛋白定量按说明书步骤进行，首先混合好A和B液，取80 μL混合液加入96孔板中；取蛋白标准品（4、2、1、0.5、0.25、0 μL）和裂解好的蛋白样品4 μL分别加入混合液中，37℃孵育30 min。采用酶标仪在562 nm波长下测定计算蛋白质浓度。

1.9Western blot检测对照组和试验组各取50 μg的蛋白样品，加入1/2体积的3×聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）加样缓冲液，煮沸5 min，进行电泳。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，封闭1 h后，分别加入合适稀释浓度的一抗（稀释比例分别为AKT 1∶500、p-AKT 1∶1 000），4℃冰箱孵育过夜；吐温缓冲液TBST洗3次，再加入1∶10 000稀释的二抗（HRP标记的羊抗兔及羊抗鼠IgG）。室温孵育1.5 h。ECL显色法显色，X光胶片扫描成像。结果以GAPDH表达量定为1，以均数±标准差（±s）表示AKT及p-AKT的相对表达量。

1.10统计方法应用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料以均数 ±标准差（±s）表示，计数资料以百分率表示。多组、多个时间点比较用Univariate，SNK法，多组间同一时间点比较用 One-Way ANOVA、LSD/SNK法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CCK-8检测结果图1结果显示：大鼠空白血清对OCI-ly10细胞活力基本无影响，各含药血清组（10%～50%含药血清）对OCI-ly10细胞均有生长抑制作用，其中以30%、40%、50%含药血清对细胞抑制作用较明显，且随时间延长，抑制作用越显著（P＜0.01）。本研究取30%含药血清作为后续试验选用血清。

图1　CCK-8法检测益气除痰方对淋巴瘤细胞OCI-ly10的抑制作用Figure 1　Inhibitory effect of QPR on OCI-ly10 detected by CCK8　（±s，N=3）

2.2流式细胞术检测结果表1及图2结果显示：联合组、阿霉素组、含药血清组的凋亡率均显著高于阴性对照组，其中联合组促进肿瘤细胞凋亡的作用显著强于阿霉素组及含药血清组（P＜0.01）。

表1　各组对细胞凋亡率的影响Table 1 Comparison of apoptotic rate in various groups　（±s）

表1　各组对细胞凋亡率的影响Table 1 Comparison of apoptotic rate in various groups　（±s）

①P＜0.01，与阴性对照组比较；②P＜0.01，与联合组比较

组别阴性对照组阿霉素组含药血清组联合组N 3 3 3 3 p凋亡率/% 1.1±1.53 36.7±1.79①②42.9±2.01①②63.0±1.22①

图2　各组诱导OCI-ly10细胞凋亡流式细胞图Figure 2　Flow cytometry results of OCI-ly10 apoptosis in various groups

2.3各组AKT及p-AKT的表达结果表2及图3结果显示，30%益气除痰方含药血清作用48 h后，与阴性对照组比较，含药血清组AKT及p-AKT （Thr308）的表达水平显著下降，而p-AKT（Ser473）的表达水平显著升高（均P＜0.05）。

表2　各组AKT、p-AKT相对表达比较Table 2 Comparison of relative expression of AKT and p-AKT in various groups　（±s，p）

表2　各组AKT、p-AKT相对表达比较Table 2 Comparison of relative expression of AKT and p-AKT in various groups　（±s，p）

①P＜0.05，与对照组比较

组别对照组中药组N 3 3 AKT 1.07±0.23 0.09±0.02①p-AKT（Thr308）0.29±0.07 0.11±0.04①p-AKT（Ser473）0.01±0.02 0.12±0.05①

图3　各组AKT、p-AKT的表达凝胶电泳图谱Figure 3 Gel electrophoresis results for the expression of AKT and p-AKT in various groups

3　讨论

中医重视辨证论治，因人而异，在淋巴瘤的治疗上有独特优势。中医认为：“无痰不作结”，《外科正宗》亦云：失荣者，因六欲不遂，损伤中气，郁火所凝，坠痰失道，停结而成。故恶性淋巴瘤其病因之本在于虚与痰。林丽珠等［3］认为恶性淋巴瘤以正虚为本，主要是脏腑气血阴阳失调，气滞、痰浊、水湿、瘀血、癌毒相互搏结而成。病机主要责于内虚与痰结，故补虚和祛痰为治疗关键。

益气除痰方是本院肿瘤科所创经典治癌良方，全方通过益气、消积、清利而共奏化痰之功，标本兼顾。其中，西洋参补气养阴、益肺生津，生半夏及山慈菇散坚消结、化痰解毒等。现代研究表明西洋参的最主要活性成分为皂苷类，目前西洋参皂苷类成分已经分离鉴定出49种；西洋参除了传统的生理活性外，其中所含人参皂苷在抑制肿瘤细胞生长或转移、诱导肿瘤细胞凋亡和分化、逆转肿瘤多药耐药等生理活性方面具有很高价值［4］。生半夏抗肿瘤的主要成分为半夏多糖，对小鼠子宫颈癌14、肉瘤180、肝癌HCA及Hela细胞、胃腺癌细胞系BGC2823等有明显的抑制作用［5］。山慈菇抗肿瘤的有效成分为秋水仙碱及其衍生物秋水仙酰胺，其抗肿瘤机理在于抑制微管蛋白，阻滞有丝分裂，使细胞分裂停止于中期，广泛用于多种肿瘤的治疗［6］。

本研究发现，在益气除痰方含药血清作用下，DLBCL OCI-ly10细胞的生长受到明显抑制，并且与含药血清浓度及用药时间成正比，进一步研究发现这种抑制主要与DLBCL细胞的凋亡增加有关。文献报道DLBCL的凋亡与若干异常激活的生长信号传导通路有关，其中最重要的是磷脂酰肌醇-3羟基激酶（PI3K）所介导的PI3K/PTEN/AKT信号通路［7］，激活的机制包括催化亚单位p110α的扩增［8］，及张力蛋白同源的磷酸酶（PTEN）缺失［9］等。PI3K与胞膜表面活化后的B细胞受体（BCR）胞内酪氨酸激酶区结合后，激活催化亚单位p110α。p110α可通过消耗ATP使4，5－双磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）转化为第二信使3，4，5－三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）。PIP3进一步磷酸化下游丝氨酸/苏氨酸激酶AKT保守区域，使其充分激活。PI3K/PTEN/AKT作为该信号通路的上游分子，可以通过激活多种下游底物，对DLBCL细胞的生长、迁移及凋亡等发挥重要作用［7］。本课题组前期的研究也发现在原发胃和肠道MALT（部分MALT淋巴瘤最终转化为DLBCL）和DLBCL淋巴瘤中存在PI3K的催化亚单位—PIK3CA（p110α）蛋白的过表达（40%阳性），并证明阳性表达的患者无进展生存期更短，预后更差（P＜0.05），从而为DLBCL淋巴瘤中PI3K/AKT通路的激活提供了有力的证据支持［10］。

基于文献报道，本研究进一步探讨益气除痰方诱导DLBCL细胞凋亡与PI3K/PTEN/AKT信号通路的关系。结果发现在含药血清作用下，不论是非磷酸化AKT还是磷酸化AKT蛋白（Thr308）表达都出现了明显下降，这说明益气除痰方可通过抑制PI3K/PTEN/AKT信号通路中的关键靶点AKT来抑制DLBCL细胞生长。而磷酸化AKT蛋白（Ser473）表达升高，可能与下游通路分子受到抑制产生负反馈影响有关［10］。既往孙玲玲［11］与周京旭［12］等均发现益气除痰方可以促进肺癌A549细胞的失巢凋亡，并且凋亡原因部分与P-AKT的抑制相关。本研究结果与前述实体瘤的研究结果基本相符。由于血液系统肿瘤属于非上皮来源肿瘤，其发生过程及临床表现与上皮来源的肺癌等有很大差别，但从肿瘤细胞凋亡的分子生物学机理上来讲，两者其实有很多共同之处，比如可以依赖相同的信号传导通路。这也为中医药临床“异病同治”提供了理论基础。

综上所述，本研究通过体外实验证实了益气除痰方治疗DLBCL的有效性，并对其中的机制从细胞信号传导通路的角度进行了初步探索，发现AKT蛋白是益气除痰方诱导凋亡的靶蛋白。基于以上结果，后续研究将对益气除痰方作用下的DLBCL PI3K/PTEN/AKT信号通路下游分子作进一步探索。

［1］A clinical evaluation of the International Lymphoma Study Group classification of non-Hodgkin’s lymphoma.The Non-Hodgkin’s LymphomaClassificationProject［J］.Blood，1997，89（11）：3909.

［2］周岱翰，林丽珠，周宜强，等.中西医结合治疗非小细胞肺癌近期疗效观察［J］.中国中西医结合杂志，2005，25（12）：1061.

［3］肖志伟.林丽珠教授治疗恶性淋巴瘤经验［J］.湖南中医杂志，2010，26（3）：46.

［4］王炜明，赵东娇.西洋参中有效成分及其抗肿瘤关系的研究进展［J］.中国民族民间医药，2013，22（10）：43.

［5］赵永娟，王蕾，侯琳，等.半夏多糖抗肿瘤作用研究［J］.中国药理学通报，2006，22（3）：368.

［6］张正海，李爱民，魏盼盼.山慈菇应用现状及研究方向［J］.特产研究，2009，31（4）：74.

［7］UddinS，HussainAR，Siraj，AK，etal.Role of phosphatidylinositol 3’-kinase/AKT pathway in diffuse large B-cell lymphoma survival［J］.Blood，2006，108（13）：4178.

［8］Cui W，Cai Y，Wang W，et al.Frequent copy number variations of PI3K/AKT pathway and aberrant protein expressions of PI3K subunits are associated with inferior survival in diffuse large B cell lymphoma［J］.J Transl Med，2014（12）：10.

［9］Pfeifer M，Grau M，Lenze D，et al.PTEN loss defines a PI3K/ AKT pathway-dependent germinal center subtype of diffuse large B-cell lymphoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110 （30）：12420.

［10］Zhai L，Zhao Y，Ye S，et al.Expression of PIK3CA and FOXP1 in gastric and intestinal non-Hodgkin’s lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue type［J］.Tumour Biol，2011，32（5）：913.

［11］孙玲玲，林丽珠.益气除痰方对A549细胞增殖及grp78，AKT表达的影响［J］.中国科技论文在线，2011：1.

［12］周京旭，宋妮，孙玲玲，等.益气除痰方抑制p-AKT活性诱导 A549细胞失巢凋亡的研究［J］.成都中医药大学学报，2014，37（2）：38.

【责任编辑：黄玲】

Effect of Qi-benefiting and Phlegm-eliminating Recipe on Proliferation and Serine/threonine-protein Kinase AKT Expression of Diffused Large B-cell Lymphoma Cells

ZHAI Linzhu1，CHEN Changming1，ZHAO Yuanyuan2，LIN Lizhu1
（1.Center of Neoplasms，the First Affiliated Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405 Guangdong，China；2.Dept.of Medical Oncology，Cancer Center of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510060 Guangdong，China）

Objective To investigate the effect of Qi-benefiting and Phlegm-eliminating Recipe（QPR）on the proliferation of diffused large B-cell lymphoma cells（OCI-ly10）and to explore its mechanism.Methods The inhibitory effect of QPR on the proliferation of OCI-ly10 cells was detected by Cell Counting Kit-8（CCK8）.The apoptosis of OCI-ly10 induced by QRP and doxorubicin was determined by flow cytometry combined with Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide（FITC/PI）staining method.The effect of QPR on the expression of serine/threonine protein kinase AKT and phosphorylated-AKT（Thr308 and Ser 473）was evaluated by Western blotting method.Results The growth of OCI-ly10 was inhibited by QPR-containing serum in time-concentration-dependent manner.The apoptotic rate of combination group（treated by QPR-containing serum and doxorubicin），doxorubicin group and QPR-containing serum group was significantly higher than that of the negative control group，and the combination group had the highest apoptotic rate（P＜0.05）.The results of Western blotting showed that AKT and p-AKT（Thr308）expression levels were down-regulated by QPR-containing serum（P＜0.05）.Conclusion QPR is effective on inhibiting OCI-ly10 growth and promoting OCI-ly10 apoptosis，and can enhance the anti-tumor effect of doxorubicin.Its possible mechanism may be associated with the inhibition of p-AKT related signaling pathway.

Qi-benefiting and Phlegm-eliminating Recipe；diffused large B-cell lymphoma/TCM-WM therapy；apoptosis；AKT；protein expression；cell culture

R285.5

A

1007-3213（2016）04-0556-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.026

2015-11-23

翟林柱（1980-），男，医学硕士，副主任医师；E-mail：linzhuzhai@163.com

林丽珠，女，博士，主任医师，博士研究生导师；E-mail：lizhulin903@139.com

国家自然科学基金青年基金项目（编号：81403228）；广东省医学科研基金项目（编号：B2014176）；广东省科技计划项目（编号：2013B021800225）；广州中医药大学优秀青年学者科研基金项目