内源微生物驱油功能菌定量化分析技术

胡　婧，吴晓玲

（1.中国石油化工股份有限公司胜利油田分公司石油工程技术研究院，山东东营257000）

内源微生物驱油功能菌定量化分析技术

胡婧，吴晓玲

（1.中国石油化工股份有限公司胜利油田分公司石油工程技术研究院，山东东营257000）

为了解决培养法无法对油藏内驱油功能菌进行定量检测的难题，利用荧光定量PCR技术，通过对功能基因进行定量实现了油藏内产脂肽菌、产甲烷菌的定量化检测，其中产脂肽菌选择srfA基因、产甲烷菌选择mcrA基因。结果发现，该方法具有很好的特异性和重复性，标准曲线的相关系数达到0.99以上，扩增效率达到100%。在检测未知样品时，证实该方法的检测下限可以达到10拷贝/μL。利用该技术监测了胜利油田沾三区块驱油一口油井（Z3-X24）在内源微生物驱油过程中2种功能菌的定量化变化，数据表明:内源激活前期，产脂肽菌密度快速升高到104拷贝/μL，内源激活后期，厌氧的产甲烷古菌密度升高到104拷贝/μL，该数据表明微生物驱油过程中存在好、厌氧菌的演替规律，将2种菌的定量检测结果与现场油井的产量进行对比，发现油井日油水平的动态变化与这2种菌的动态变化存在明显对应关系。该研究建立的功能菌定量化检测技术为内源微生物驱油现场实施效果的准确预测及驱油机理分析提供了一个有效的分析手段，可以进一步提高微生物驱油工艺措施的针对性和有效性。

产脂肽菌；产甲烷菌；定量化检测

油藏内的微生物是微生物驱油技术的物质基础，通过激活或注入油藏内具有特定功能的细菌，通过它们自身及产生的代谢产物来提高原油采收率，所以定量检测驱油功能菌的密度变化是微生物驱油效果预测及现场实施方案调整的基础［1-4］。油藏中大部分的细菌在室内都是不可培养的，利用传统的培养法只能定量检测油藏中小于1%的细菌，故急需建立一种快速、准确的油藏功能菌定量检测方法［5-6］。

荧光定量PCR技术（real-time quantivative polymerase chain reaction，RT-PCR）是在普通PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术，在PCR反应体系中添加荧光基团，通过荧光信号的累积来实时监控PCR的进程，最后通过荧光阈值的循环数和已知标准质粒的浓度与循环阈值构建的标准曲线对未知样品的其实浓度进行定量［7-10］。目前，该方法是定量检测环境样品中不同细菌的最准确和最灵敏的方法，已广泛应用于肠道、食品、土壤中特定类群细菌的定量检测［11-15］。该方法在油藏微生物上的应用不多，Li等［16］利用该技术检测了油藏中的厌氧氨氧化菌，发现检测的17个油藏样品中有9个含有丰富的氨氧化菌。司风彬［17］利用RT- PCR技术构建了油藏嗜烃菌的定量检测技术，分析了新疆六口区4口油井在采油过程中该菌密度变化，并与传统的最大或然数（MPN）计数进行比较，确定了RTPCR技术在进行油藏功能菌检测时的可行度。

本文中，笔者利用RT-PCR技术构建了油藏产甲烷菌以及产脂肽菌的定量检测方法，并将该方法应用到胜利油田沾3区块内源微生物驱油的油水井监测中，通过检测数据的分析明确这两种功能菌与现场生产动态之间的关系，以期为沾3区块微生物驱油效果的分析提供可靠的数据支撑。

1　材料与方法

1.1标准质粒构建

根据产脂肽菌及产甲烷菌的代谢功能，选择相应的功能基因为检测目标，产脂肽菌选择srfA基因，产甲烷菌选择mcrA基因。选取普遍存在于胜利油藏的芽胞杆菌属和甲烷嗜热杆菌属的细菌［18］作为构建标准质粒的细菌，分别为本实验室在胜利油藏筛选的枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）和热自养甲烷杆菌（Methanothermobacter thermautotrophicus），其中SrfA基因的扩增引物为srfA- F-5′CAAAAKCGCAKCATACCACKTTGAG3′和srfA-R 5-′TCATARAGCGGCAYATATTGATGC-3′，mcrA的扩增引物为mcrAF -5′RCGTTCATBGCGTAGTTVGGRT- 3′和mcrAR -5′GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3′，所有引物委托TaKaRa公司合成。扩增程序:预变性98℃5 min；98℃15 s、60℃30 s、72℃30 s，该步骤循环35次；72℃延伸10 min。扩增后的标准质粒构建委托TaKaRa公司进行。

1.2现场样品处理及DNA提取

实验所用油藏水样来自胜利油田沾3区块的1口油井（Z3-X24），油水样从井口直接采集到无菌的样品桶中。为了减低井口的污染，每次取样前排掉2 L左右的油水样后再进行水样采集，每个样品采集10 L油水样，当天运回实验室，样品处理前保存在-4℃。

油藏油水样中的菌体通过高速离心（12 000 r/min、15 min）进行收集，为了减少原油对菌体的吸附，每次离心前在离心杯中加入50 mL石油醚，离心后油水分离，细菌沉淀于离心杯底。为了收集足够多的菌体，每个样品都重复离心6 L液体。菌体DNA的提取利用AxyPrep基因组提取试剂盒。提取后的DNA溶解在100 μL的TE缓冲液中，利用nanodrop进行浓度检测后置于-70℃保存，作为后期功能菌基因RT PCR反应的模板［19］。

1.3荧光定量PCR反应

RT- PCR反应利用的仪器为Bio-Rad公司的IQ5。反应试剂为Bio-Rad公司的SYBR®Green supermix，反应体系为未知样品模板以及标准质粒，样品都为1 μL，引物终浓度为1 pmol/L，10 μL supermix，最后用灭菌的去离子水调整体系到20 μL。反应程序:95℃3 min；95℃10 s，60℃30 s，收集荧光，扩增40个循环；溶解曲线分析，60℃逐渐升温到95℃，每隔0.5℃收集一次荧光。标准质粒与未知样品同时进行反应，浓度梯度选择1×108、1×106、1× 104和1×102拷贝/μL。荧光定量PCR反应后数据分析由Bio-Rad iQ5荧光定量PCR仪自带的分析软件完成，现场检测样品可以根据其Ct值（每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数）在生成的标准曲线上查到对应的基因拷贝数。

2　结果与讨论

2.1标准曲线构建

利用荧光定量PCR技术构建了油藏水样中产脂肽菌及产甲烷菌的定量化检测方法，利用2种微生物构建的标准曲线见图1。由图1可以看出，构建的产脂肽菌和产甲烷菌的基因定量标准曲线具有很好的线性关系，R2均大于0.99，荧光定量PCR的反应效率很高，都在100%以上。

图1　srfA和mcrA基因的标准曲线Fig.1 Standard curve for srfA and mcrA

2.2定量方法评价

2.2.1特异性检测

利用反应过程中的溶解曲线考察了2个基因检测引物的特异性，结果见图2。由图2可以看出，2个功能基因荧光定量扩增的溶解曲线都是单一峰，说明所用的扩增引物产生的扩增条带单一，没有非特异性扩增，而且2个反应的扩增溶解（TM）值都在80～90℃之间，排除了扩增的片段是引物二聚体的可能性。从该结果可以看出，扩增用引物具有很好的扩增特异性，保证了检测结果的准确性。

图2　srfA和mcrA引物扩增的溶解曲线Fig.2 Melting curves for srfA and mcrA

2.2.2重复性检测

取检测用标准质粒高、中、低3个密度梯度（1× 106、1×104和1×102拷贝/μL）各1 μL做模板进行PCR反应，每个梯度做3个平行样，通过软件计算Ct值，结果见表1和表2。由表1和表2可知:随着质粒密度的降低，Ct值逐渐增大，低浓度重复实验间的Ct值较大，但都小于2%，在误差允许范围内，说明建立的荧光定量PCR检测方法对高、中、低3种不同密度的产脂肽菌和产甲烷菌的检测结果均具有很好的重复性。

2.3现场油藏水样分析

利用该方法检测了沾3区块内源微生物驱油过程中产甲烷菌及产脂肽菌的变化趋势，现场样品提取DNA后进行荧光定量PCR的反应曲线见图3。从图3可以看出，该方法可以满足现场油藏水样中的2种功能菌的定量检测，最低检测下限达到了10拷贝/μL，说明该方法具有很高的灵敏性。实施内源微生物激活前，Z3-X24的产出液中产甲烷菌功能基因mcrA的密度很低，只有102拷贝/μL，SrfA基因在初始样中检测不到。激活剂注入后检测发现，产脂肽菌的密度快速升高，到2013年4月份升高到104拷贝/μL，而产甲烷菌升高的幅度较产脂肽菌小，2013年4月份密度接近103拷贝/μL。随着这2种菌密度的升高，该井日油水平从2011年的2 t/d升高到2013年7月的6.6 t/d，产量有了明显的改善。2013年10月份，由于激活剂注入量的降低，造成2013年11月份srfA和mcrA的密度明显降低，现场日油水平减低到1.3 t/d。随着后期恢复正常的激活剂注入，srfA和mcrA呈现明显的升高趋势，该阶段mcrA的增长幅度大于srfA，到2014年10月，mcrA密度接近104拷贝/uL。srfA密度在后期呈现波动，较之前有所降低。随着产甲烷古菌密度的升高，X24日油水平也逐渐升高，到2014年7月，日油水平升高到8.5 t/d。可以看出现场油井产出液中srfA和mcrA基因的变化与原油产量之间存在一定的对应关系，这也证实了该油井产量的改善确实与现场激活剂注入后内源菌的激活有关。通过以上2种功能菌与现场生产动态之间的关系可以有效预测现场实施效果并开展针对性的方案调整。

表1　srfA重复性实验结果Table 1 Results of srfA reproducibility evaluation

表2　mcrA重复性实验结果Table 2 Results of mcrA reproducibility evaluation

图3　沾3-X24油井产出液中功能基因与日油的变化Fig.3 Relationship between two functional bacteria changes and field production performance

检测过程中，这2种功能菌的变化与内源激活的好、厌氧菌接替规律吻合，前期好氧类的产脂肽菌被快速激活，产生生物类表面活性剂以及小分子酸等代谢产物来乳化原油，提高原油采收率；当好氧类细菌的代谢产物积累到一定程度后会激活油藏内的厌氧类功能菌，如产甲烷古菌，这些厌氧细菌利用好氧阶段产生的代谢产物，产生甲烷等生物气体，改善原油流动性，提高原油采收率。

3　结论

利用RT-PCR技术实现了油藏样品中产甲烷菌和产脂肽菌的定量检测，检测下限达到了10拷贝/μL，而且具有快速、特异性强和重复性好的优势。利用所建立方法分析了胜利油田沾3区块实施内源微生物驱油前后2种功能菌的动态变化，通过分析发现:实施前2种菌的浓度都很低，激活剂注入后好氧类产脂肽菌首先被激活，到后期厌氧类产甲烷菌被激活，符合微生物驱油好厌氧菌接替的规律。同时分析发现，沾3区块油井原油产量的动态变化与功能菌的变化有明显的对应关系，利用这种关系可以对微生物现场实施的效果进行预测并为后期实施方案的调整提供理论依据。

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（责任编辑 荀志金）

Quantification of bacteria responsible for endogenous microbial enhanced oil recovery

HU Jing，WU Xiaoling
（Research Institute of Petroleum Engineering Technology，Shengli Oilfield Company，Sinopec，Dongying 257000，China）

We used the rapid SYBR®Green fluorescent quantitative real-time PCR technique to detect lipopeptide producing bacteria and methanogenic archaea present in the reservoir.The recombinant plasmid containing srfA and mcrA gene was used as standards to generate a standard curve for lipopeptide producing bacteria and methanogenic archaea.The sensitivity，reproducibility and specificity of the technique were evaluated.The correlation coefficient（R2）of the standard curve was above 0.99 and the amplification efficiency reached 100%.To detect unknown samples，the detection limit of the method reached 10 copies/μL.Water samples collected in the oil well Z3-X24 located in Zhan3 block of Shengli oilfield were detected using the technique.The concentration of lipopeptide producing bacteria increased to 104copies/μL in the early stage of endogenous activation，while the concentration of methanogenic archaea increased to 10 copies/μL in the late stage of endogenous activation.The data confirmed there was a good successive ruler between aerobic and anaerobic bacteria in the process of MEOR.We found a correlatin between these two functional bacteria dynamics and the oil production.These results are essential for understanding oil-displacement mechanism of indigenous MEOR and providing scientificguidance to the performance of MEOR technology in the future.

lipopeptide producing bacteria；methanogenic archaea；quantitative detection

TE357.9

A

1672-3678（2016）03-0023-04

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.03.005

2016-02-14

国家高技术研究发展计划（863计划）（2013AA064401）

胡 婧（1980—），女，河南许昌人，博士，研究方向:微生物采油，E-mail:tomatohu@163.com