壮骨止痛方对去卵巢骨质疏松大鼠下丘脑神经肽Y及α-促黑素的影响

易仲媛　甘国兴　郭小玲　刘　毓　饶剑花　李笔锋.广东省清远市中医院药学部，广东清远　5500；.广东省清远市中医院科教部，广东清远　5500；.广东省清远市中医院骨科中心，广东清远　5500

壮骨止痛方对去卵巢骨质疏松大鼠下丘脑神经肽Y及α-促黑素的影响

易仲媛1甘国兴2郭小玲1刘毓3饶剑花1李笔锋3
1.广东省清远市中医院药学部，广东清远511500；2.广东省清远市中医院科教部，广东清远511500；3.广东省清远市中医院骨科中心，广东清远511500

目的 观察壮骨止痛方对去卵巢骨质疏松大鼠下丘脑神经肽Y（NPY）及α-促黑素（α-MSH）的影响，探讨其抗骨质疏松机制。方法 72只200 g左右的SD大鼠随机抽出假手术组12只，造模组60只，造模组采用双侧去卵巢法造模，假手术组只切除卵巢周围相应质量的脂肪。造模成功后，将造模组大鼠随机分为模型组、壮骨止痛方高剂量组（13.2 g/kg）、壮骨止痛方中剂量组（6.6 g/kg）、壮骨止痛方低剂量组（3.3 g/kg）和戊酸雌二醇组，每组12只。术后第5天开始药物干预，模型组和假手术组给予相应体积的纯净水，持续13周。给药结束后，检测大鼠骨密度和下丘脑NPY及α-MSH含量。结果 假手术组大鼠下丘脑NPY含量为 （59.6395±6.4535）ng/L，α-MSH含量为（5.8261±0.6375）ng/L，股骨骨密度为（0.3485±0.0780）g/cm2。与假手术组比较，模型组大鼠下丘脑NPY含量［（73.8488±7.0814）ng/L］显著增加，α-MSH含量［（5.0314±0.5442）ng/L］显著降低，股骨骨密度［（0.3045±0.0650）g/cm2］显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，壮骨止痛方高剂量组大鼠下丘脑NPY含量［（65.0930±6.3953）ng/L］显著减少，α-MSH含量［（6.0570±0.5196）ng/L］显著增加，股骨骨密度［（0.3524±0.0730）g/cm2］显著增加；壮骨止痛方中剂量组大鼠NPY含量［（58.6163±5.9419）ng/L］显著减少，α-MSH含量［（5.5766±0.5324）ng/L］显著增加，股骨骨密度［（0.3507±0.0790）g/cm2］显著增加；壮骨止痛方低剂量组大鼠NPY含量［（54.9419±4.6512）ng/L］显著减少，α-MSH含量［（5.8743±0.4813）ng/L］显著增加，股骨骨密度［（0.3498±0.0690）g/cm2］显著增加，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结论 促进α-MSH合成、抑制NPY分泌可能是壮骨止痛方抗骨质疏松的作用机制之一。

骨质疏松；壮骨止痛方；神经肽Y；α-促黑激素

研究发现一些神经肽类物质如神经肽Y（NPY）等介导神经骨骼信号在骨代谢中发挥着重要作用，它们通过调节成骨细胞和破骨细胞活性及骨组织微循环参与骨代谢［1-2］。壮骨止痛方由补骨脂、女贞子、枸杞子、淫羊藿、骨碎补、川牛膝等7味中药组成，具有补益肝肾、壮骨止痛的功效，能有效治疗骨质疏松症［3］，但是其抗骨质疏松机制尚未完全明确，前期研究发现壮骨止痛方能够提高模型鼠血清雌激素水平，调节骨代谢相关激素，调节骨组织基质金属蛋白酶（MMP）-2、护骨因子（OPG）、雌激素相关受体α（ERRα）等基因和蛋白表达，多靶点、多环节、多通路抗骨质疏松［4-10］。近年来研究发现，瘦素及其信号传导通路具有调节骨代谢的作用［11-13］。本研究通过探讨壮骨止痛方对去卵巢骨质疏松大鼠下丘脑NPY及α-促黑素（α-MSH）的影响，从调节神经骨骼信号探讨其抗骨质疏松的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物

72只3月龄SPF级SD雌性大鼠，体重（220±15）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物质量合格证号：No.43004700005517，中南大学湘雅三医院动物实验中心许可证号：SYXK（湘）2013-0001。饲料为湖南斯莱克景达实验动物有限公司标准普通饲料。

1.2仪器

双能X线骨密度仪（意大利Unigamma公司），酶标仪（BioTek，USA），CP214电子天平（奥豪斯仪器有限公司），Shandon325型石蜡切片机（英国Shandon公司），LKB-Ⅲ型超薄切片机（瑞典），MIAS医学图像分析系统、Motic B5显微摄像系统等。

1.3药物与试剂

壮骨止痛方药材购自长沙九芝堂股份有限公司，由中南大学药学院李劲平教授鉴定；戊酸雌二醇片（拜耳医药保健有限公司广州分公司，J20130009）；NPY 及α-MSH酶联免疫吸附测定 （ELISA）检测试剂盒（上海邦奕生物科技有限公司）。

1.4方法

1.4.1药物制备补骨脂和女贞子先用6倍体积70%乙醇回流提取2 h，过滤，再加4倍体积70%乙醇回流提取2 h，过滤，合并滤液减压回收乙醇得流浸膏A备用；乙醇提取后的药渣与处方其他药材一起加10倍蒸馏水煎煮2 h，过滤，药渣再加8倍水煎煮1.5 h，过滤，合并滤液，减压浓缩至相应浓度得流浸膏B，将A 与B合并调整浓度相当生药浓度1.32 g/mL为高剂量。用蒸馏水稀释成浓度0.66 g/mL为中剂量，稀释成浓度0.33 g/mL为低剂量。

1.4.2造模72只3月龄SPF级SD雌性大鼠适应性饲养7 d后，随机选取12只为假手术组，其余采用双侧去卵巢法造模。大鼠用水合氯醛麻醉后，在无菌条件下从距离大鼠第1胸腰椎外侧1 cm处纵向切开皮肤及两侧肌肉，摘除双侧卵巢，假手术组仅在卵巢周围切除相应质量的脂肪，分两层缝合伤口并用生理盐水擦洗干净血迹，术后连续3 d大腿肌内注射青霉素，每只大鼠40 000 U/d。饲养于室温23～25℃、相对湿度50%～70%的清洁环境中，自由摄食和摄水。经上述处理后的大鼠，以阴道上皮角化试验验证模型是否成功，连续5 d阴道监测未见动情周期证明造模成功，可用于进一步的实验。

1.4.3分组与给药造模成功后，将造模大鼠随机分为模型组、壮骨止痛方高剂量组、壮骨止痛方中剂量组、壮骨止痛方低剂量组、戊酸雌二醇组，加上假手术组共6组，每组12只大鼠。从术后第5天开始，各组开始灌胃给药干预，持续13周。给药剂量根据人鼠体表面积换算，壮骨止痛方高剂量相当于生药13.2 g/kg，壮骨止痛方中剂量相当于生药6.6 g/kg，壮骨止痛方低剂量相当于生药3.3 g/kg，戊酸雌二醇0.021 mg/kg。给药体积均为1mL/100 g，模型组和假手术组给予等体积的纯净水。

1.4.4标本采集及检测灌胃给药干预结束后，大鼠用水合氯醛麻醉，腹主动脉采血后，迅速取出下丘脑并匀浆，取上清液按照试剂盒说明书采用ELISA法检测NPY及α-MSH含量。取右后侧股骨和胫骨，剔除骨周围肌肉组织，双能X线骨密度仪测定股骨骨密度，胫骨用4%的多聚甲醛固定48 h，然后用5%的硝酸脱钙1周，石蜡包埋后切片机切片，显微形态学计算机网络系统测量胫骨平均骨小梁密度。

1.5统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，进行单因素方差分析，所有数据经过方差齐性检验和正态性检验，方差齐的采用LSD检验，方差不齐的采用Tamhane方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度的影响

与假手术组比较，模型组去卵巢后大鼠股骨骨密度显著下降（P＜0.01）；与模型组比较，戊酸雌二醇组和壮骨止痛方各剂量组大鼠股骨骨密度明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1　对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度及骨组织形态学的影响（±s）

表1　对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度及骨组织形态学的影响（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别　只数剂量（g/kg）骨密度（g/cm2）骨小梁密度（g/cm2）假手术组模型组戊酸雌二醇组壮骨止痛方高剂量组壮骨止痛方中剂量组壮骨止痛方低剂量组12 12 12 12 12 12 --2.1×10-513.2 6.6 3.3 0.3485±0.0780 0.3045±0.0650*0.3387±0.0810#0.3524±0.0730##0.3507±0.0790##0.3498±0.0690##0.8763±0.0080 0.7056±0.0090*0.7908±0.0120##0.8689±0.0130##0.8562±0.0080##0.8485±0.0100##

2.2对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织形态学的影响

在10×40倍镜下，通过显微形态学计算机网络系统测量右后胫骨骨小梁密度，每张切片取5个视野，取其平均值。与假手术组比较，模型组大鼠骨小梁密度显著减小（P＜0.01），与模型组比较，戊酸雌二醇组和壮骨止痛方各剂量组大鼠骨小梁密度均显著增加，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。镜下显示，模型组大鼠骨小梁稀疏、破坏，骨髓腔扩大，梁髓比明显下降。假手术组大鼠骨小梁分布均匀，梁髓比正常；戊酸雌二醇组和壮骨止痛方各剂量组大鼠骨小梁密度分布比较均匀，梁髓比基本恢复正常，骨组织病理形态显著改善。见图1。

图1　各组大鼠骨组织形态学（10×40）

2.3对去卵巢骨质疏松大鼠下丘脑NPY及α-MSH的影响

与假手术组比较，模型组大鼠下丘脑NPY含量显著增加，α-MSH含量显著下降，差异有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。与模型组比较，戊酸雌二醇组大鼠下丘脑NPY含量显著下降（P＜0.01），α-MSH含量显著增加（P＜0.05）；壮骨止痛方高、中、低剂量组大鼠下丘脑NPY含量显著下降（P＜0.05或P＜0.01），α-MSH含量显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。

表2　对去卵巢骨质疏松大鼠下丘脑NPY及α-MSH的影响（ng/L，±s）

表2　对去卵巢骨质疏松大鼠下丘脑NPY及α-MSH的影响（ng/L，±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；NPY：神经肽Y；α-MSH：α-促黑素

组别　只数剂量（g/kg）　NPY　α-MSH假手术组模型组戊酸雌二醇组壮骨止痛方高剂量组壮骨止痛方中剂量组壮骨止痛方低剂量组12 12 12 12 12 12 --2.1×10-513.2 6.6 3.3 59.6395±6.4535 73.8488±7.0814**64.1047±4.8372##65.0930±6.3953#58.6163±5.9419##54.9419±4.6512##5.8261±0.6375 5.0314±0.5442*5.7593±0.6320#6.0570±0.5196##5.5766±0.5324#5.8743±0.4813#

3　讨论

骨质疏松症又称骨萎缩症，是指随着年龄增长，成人骨质流失加快，骨量减少，骨质变薄、变脆，易发生骨折。老年性或绝经后骨质疏松最为常见。近年来研究发现，瘦素及其信号传导通路具有调节骨代谢的作用。瘦素在中枢主要是间接调节骨代谢，NPY和α-MSH是瘦素信号的两个基本介质。在下丘脑瘦素直接抑制NPY mRNA的表达［14］。瘦素可使NPY的功能减弱，使α-MSH的功能增强［15］。NPY和α-MSH在调节摄食、代谢和皮质激素功能等方面具有相反的作用［16］，所以，推测NPY和α-MSH在调节骨代谢方面也同样具有相反的作用。NPY是调节瘦素活动的下游调节器［17］，在下丘脑的弓状核神经元，NPY神经元能表达瘦素受体和Y2受体，Y2受体主要调节骨代谢。给野生鼠第三脑室静脉注射NPY，与注射瘦素一样引起骨丢失，说明瘦素和NPY在控制骨形成方面的作用是一致的［18-20］。目前认为下丘脑NPY靠神经内分泌作用和自主神经机制影响外周骨组织。α-MSH是一种神经内分泌激素，与黑皮质素受体（melanocortin receptor，MCR）结合，在调节能量代谢、食欲、免疫等发挥重要作用［21-22］。研究发现，α-MSH与骨代谢有关［23］。体外骨髓细胞培养时，α-MSH可以促进破骨细胞形成。

本研究中，去卵巢骨质疏松模型组大鼠下丘脑NPY显著增加，α-MSH显著降低，骨密度显著下降。朱晓峰等［24］研究发现，去卵巢骨质疏松大鼠血清NPY含量明显升高，骨组织NPY蛋白和mRNA的表达量明显升高，提示NPY和α-MSH能够调节骨代谢，在骨质疏松形成中有一定的作用，综合文献报道，推测可能是NPY抑制骨形成，α-MSH促进骨形成的同时促进破骨细胞形成，而NPY抑制骨形成的作用更强。给药干预后，壮骨止痛方各剂量组大鼠下丘脑NPY显著下降，α-MSH显著增加，提示壮骨止痛方可能通过调节NPY和α-MSH等神经骨骼信号治疗骨质疏松，其具体作用机制还要进一步深入研究。

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Effect of Zhuanggu Zhitong Prescription on neuropeptide Y andαmelanocyte stimulating hormone in the hypothalamus of ovariectomized rats with osteoporosis

YIZhongyuan1GAN Guoxing2GUO Xiaoling1LIU Yu3RAO Jianhua1LIBifeng3
1.Department of Pharmacy，Qingyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Province，Qingyuan 511500，China；2.Department of Science and Education，Qingyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Province，Qingyuan511500，China；3.Orthopedic Center，Qingyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Province，Qingyuan511500，China

Objective To observe the effect of Zhuanggu Zhitong Prescription on the neuropeptide Y（NPY）andαmelanocyte stimulating hormone（α-MSH）in the hypothalamus of ovariectomized rats with osteoporosis and to investigate its mechanism of anti-osteoporosis.Methods Seventy two SD rats weighed about 200 g were randomly divided into sham operation group（12 rats）and model group（60 rats），the model group was bilateral ovariectomized，the sham operation group was excised equal weight fat around the ovary.After the modeling，the rats were randomly divided into model group，Zhuanggu Zhitong Prescription high-dose group（13.2 g/kg），Zhuanggu Zhitong Prescription middle-dose group（6.6 g/kg），Zhuanggu Zhitong Prescription low-dose group（3.3 g/kg）and estradiol valerate group，with 12 rats in each group.5 days after operation，drug therapy was started，the model group and sham operation group were given equal volume of water for 13 weeks.After the drug delivery，the bone mineral density and contents of NPY and α-MSH in the hypothalamus were detected.Results In the sham operation group，the content of NPY in the hy-pothalamus was（59.6395±6.4535）ng/L，the content ofα-MSH was（5.8261±0.6375）ng/L，and the femoral bone mineral density was（0.3485±0.0780）g/cm2.Compared with the sham operation group，the content of NPY in the hypothalamus of model group［（73.8488±7.0814）ng/L］was significantly increased，and theα-MSH［（5.0314±0.5442）ng/L］was significantly declined，the bone mineral density［（0.3045±0.0650）g/cm2］was significantly declined，there were statistically significant differences（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with the model group，the content of NPY in the Zhuanggu Zhitong Prescription high-dose group［（65.0930±6.3953）ng/L］was significantly declined，the content ofα-MSH［（6.0570±0.5196）ng/L］was significantly increased，the femoral bone mineral density［（0.3524±0.0730）g/cm2］was significantly increased（P＜0.05）；the content of NPY in the Zhuanggu Zhitong Prescription middle-dose group［（58.6163±5.9419）ng/L］was significantly declined，the content ofα-MSH［（5.5766±0.5324）ng/L］was significantly increased，the femoral bone mineral density［（0.3507±0.0790）g/cm2］was significantly increased；the content of NPY in the Zhuanggu Zhitong Prescription low-dose group［（54.9419±4.6512）ng/L］was significantly declined，the content of α-MSH［（5.8743±0.4813）ng/L］was significantly increased，the femoral bone mineral density［（0.3498±0.0690）g/cm2］was significantly increased，the differences were all statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Promoting the expression ofα-MSH and restraining the secretion of NPY may be one of the mechanism of Zhuanggu Zhitong Prescription in anti-osteoporosis.

Osteoporosis；Zhuanggu Zhitong Prescription；Neuropeptide Y；α-melanocyte stimulating hormone

R285.5

A

1673-7210（2016）01（b）-0020-04

2015-10-13本文编辑：张瑜杰）

广东省清远市社会发展领域自筹经费科技计划项目（2015B055）。

甘国兴（1984.10-），男，硕士研究生；研究方向：中药新药开发与研究。