我校新开教学实验“荷包牡丹碱的分离纯化”的设计

韦　琨　蔡　乐　刘　金　周　皓　曹秋娥云南大学化学科学与工程学院，云南昆明　650091

我校新开教学实验“荷包牡丹碱的分离纯化”的设计

韦琨蔡乐刘金周皓曹秋娥
云南大学化学科学与工程学院，云南昆明650091

天然药物化学是药学专业的重要的专业必修课程，其配套实验课程设计对于该课程的教学非常重要。云南大学化学科学与工程学院新开了一个天然药物化学教学实验——荷包牡丹碱的分离纯化。本实验通过甲醇超声提取、硅胶柱层析划段和甲醇重结晶三个步骤，即可从云南传统中药地不容中获得纯度较高的荷包牡丹碱。本实验简便、高效且易于操作，适合用于制药工程专业本科生的实验教学。

荷包牡丹碱；提取分离；天然药物化学；制药工程专业

天然药物化学是制药工程专业一门重要的专业必修课程，主要研究天然药物主要有效成分的结构类型、生源途径、理化性质、提取分离及结构鉴定等［1］。天然药物化学实验课程是为了更好地掌握天然药物化学理论课程的教学内容，配套设计的各类化合物的提取分离和结构表征实验，是天然药化理论知识和实际操作的纽带，通过该实验课程能够更好地培养学生的实际操作能力和创新能力［2］。从传统中药或者药用植物中提取分离天然活性成分，不仅可以解决很多活性化合物的来源以供活性筛选或药用开发，而且可以推进中药的现代化和国际化［3］。因而，进行天然活性化合物的提取分离工艺研究，并应用于天然药物化学实验教学不仅具有很好的实用性，而且还能够调动学生的实验兴趣和学习积极性，培养学生勇于创新的精神。

1　实验研究对象的选择

云南大学化学科学与工程学院制药工程实验教学团队在设计教学试验时注重实用性，力求在传统实验教学中结合云南省地方特色，开发新的适合制药工程专业的天然产物化学教学实验。地不容（Stephania epigaea）是云南著名的传统中草药（图1），味苦而辛，性凉，有小毒，功能清热解毒、镇静、理气、止痛［4］。来自于防己科（Menispermaceae）千金藤属植物，生长于湿热河谷的石灰岩上，俗名山乌龟、地胆、金不换等。在植物分类学上属千金藤属山乌龟亚属，资源较为丰富［5-6］。研究表明，地不容中荷包牡丹碱的含量极高，荷包牡丹碱（dicentrine）属于异喹啉类阿朴菲生物碱（图1），属于天然药物化学教学内容中的一类典型生物碱，具有镇痛、镇静、抗癌［7-8］、肠道平滑肌解痉［9］、抗菌［10］及抑制肿瘤细胞生长的作用［11-12］。荷包牡丹碱的商品名为痛可宁，用于头痛、牙痛、小手术后疼痛及神经衰弱等。文献调研未见关于荷包牡丹碱提取工艺的研究，将地不容中荷包牡丹碱的提取工艺应用于本科教学，具有较好的云南地方特色，有利于提高学生对天然药物化学的学习兴趣。

图1　地不容药材和荷包牡丹碱的结构

2　实验方案的设计

经过大量的前期研究，筛选了不同的提取方法、柱层析条件和重结晶条件等，结合教学实验的条件和要求，最终确定了以下实验方案：

2.1荷包牡丹碱的提取

取地不容药材粉末50 g，采用甲醇超声提取3次，每次使用甲醇200mL，每次超声30min。抽滤，合并甲醇提取液，减压浓缩回收甲醇得到粗提物。

2.2荷包牡丹碱的分离

首先是拌样：取以上粗提物采用甲醇溶解进行拌样，硅胶（100～200目）用量为5.0 g，样品拌至完全干燥备用。然后是湿法装柱：硅胶用量为40 g，采用石油醚150mL进行分散，装入5 cm×30 cm的层析柱，把石油醚放至液面高出硅胶面2 cm左右（放出石油醚经重蒸后可回收用于柱层析），静置30 min使层析柱自然压紧。此时把拌好的硅胶通过漏斗缓慢加入层析柱中，放干溶液。最后开始柱层析：采用石油醚-丙酮（4∶1）200 mL进行洗脱，弃去此部分洗脱液，继续用石油醚-丙酮-二乙胺（60∶20∶1）200 mL进行洗脱，收集此部分洗脱液，减压浓缩，所得物含荷包牡丹碱80%以上。

2.3重结晶

取以上主要含荷包牡丹碱的所得物，加入9～11mL甲醇进行溶解，若溶解困难可在水浴上微微加热，溶解完毕后密闭，在4℃冰箱中静置24 h后（也可直接放置到下次实验时间），有沉淀析出，抽滤，用2～3mL甲醇洗涤固体，即可得到纯度大于90%的荷包牡丹碱，自然阴干后称重（得量约100 mg）。

2.4结构表征

所得荷包牡丹碱首先通过与对照品进行薄层层析色谱（TLC）比较进行确定。显色剂采用改良碘化铋钾试剂。展开剂选用氯仿-甲醇（4∶1），所得化合物与对照品Rf值一致，确定所得化合物为荷包牡丹碱。也可进一步通过核磁共振（NMR）进行结构表征，以下是荷包牡丹碱的NMR数据：

荷包牡丹碱［13-14］：1H NMR（CDCl3，400 MHz）：δ 6.42（1H，s，H-3），3.08（1H，m，H-4a），2.58（1H，m，H-4b），3.04（1H，m，H-5a），2.41（1H，m，H-5b），3.01（1H，br s，H-6a），2.97（1H，dd，J=11.6，5.8 Hz，H-7a），2.45 （1H，dd，J=11.6，5.8 Hz，H-7b），6.72（1H，s，H-8），7.60 （1H，s，H-11），5.82［1H，s，（OCH2O）a］，5.98［1H，s，（OCH2O）b］，3.84，3.86（2×3H，2×s，9，10-OCH3），2.44 （3H，s，6-NCH3）；13C NMR （CDCl3，100 MHz）：δ146.4 （s，C-1），116.4（s，C-1a），126.3（s，C-1b），141.6（s，C-2），106.6（d，C-3），126.4（s，C-3a），29.0（t，C-4），54.4 （t，C-5），62.2（d，C-6a），34.0（t，C-7），128.2（s，C-7a），111.1（d，C-8），147.5（s，C-9），148.0（s，C-10），110.3（d，C-11），123.4（s，C-11a），100.4（t，OCH2O），55.6（q，9-OCH3），55.9（q，10-OCH3），43.8（q，6-NCH3）。

3　实验教学中的注意事项

3.1药材选择

地不容药材品种较多，本实验所用药材为千金藤属地不容（S.epigaea）［15］，特别注意不要误用葫芦科雪胆属植物雪胆［16］，购买时需准确辨认。此外，其他地不容中荷包牡丹碱含量不高，比如齿叶地不容［17］和河谷地不容［18］等，不能用于该实验。

3.2粉碎程度

药材粉碎不能过细，一般过24目筛，或者粉碎成普通粗粉即可（购买药材时可直接要求粉碎），粉碎过细容易导致抽滤困难，延长试验时间。

3.3提取工艺

比较了甲醇回流、甲醇超声和0.5%盐酸水溶液渗滤（常规生物碱提取方法［19-20］）3种提取方法。结果表明甲醇回流提取成分复杂，后续分离困难，而0.5%盐酸水溶液渗滤对荷包牡丹碱的提取率很低。所以实验教学中采用甲醇超声提取最佳，既能较完全地提取荷包牡丹碱，而且引入的杂质少，有利于后续分离。

3.4柱层析洗脱剂筛选

二乙胺可以极大增加洗脱剂对荷包牡丹碱的洗脱能力。所以实验教学中应注意，第1次洗脱不加二乙胺，可以洗脱大部分杂质，而不会洗脱荷包牡丹碱。第2次洗脱须加入二乙胺，增强对荷包牡丹碱的洗脱能力，可以集中得到纯度高于80%的荷包牡丹碱。此部分会混有少量极性更大的青藤碱。

3.5重结晶甲醇用量

在保证溶解的情况下，重结晶溶剂甲醇的用量应该尽量少，可以采用加热帮助溶解，这样可以实现高纯度（大于90%）、高收率的获得荷包牡丹碱。

4　实验教学心得

荷包牡丹碱的分离纯化实验具有容易操作、试剂简单和结果可控的优点，并于去年应用于云南大学化学化学科学与工程学院制药工程专业的实验教学中，取得了良好的教学效果。本实验要求学生查阅相关文献，了解生物碱的常规提取方法和硅胶柱层析洗脱条件选择的原则。在实验过程中让学生熟悉了天然药物化学的基本操作，包括提取、柱层析和重结晶等。在实验报告的撰写过程中，要求学生思考实验中遇到的问题，比如抽滤困难与粉碎过细有关，提取效率低又和粉碎粒度、提取时间和溶剂加入量有关等，结合实验过程能够让学生更好地掌握天然药物化学实验的基本操作和实验原理。

综上所述，荷包牡丹碱的分离纯化实验适用于制药工程专业天然药物化学的实验教学。

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A new teaching experiment that the design of isolation and purification of dicentrine in our school

WEIKunCAILe LIU JinZHOU Hao CAO Qiu′e
School of Chemical Science and Technology，Yunnan University，Yunnan Province，Kunming650091，China

Chemistry of natural medicine is an important compulsory course for pharmaceutical specialty and the corresponding experiment course is also very important.A new teaching experiment for chemistry of natural medicine—isolation and purification of dicentrine is developed in School of Chemical Science and Technology，Yunnan University. In this experiment，pure dicentrine can be obtained from Stephania epigaea according to methanol ultrasonic extraction，silica gel column chromatography，and methanol recrystallization.This experiment is convenient，effective，and suitable to be a teaching experiment for the undergraduate of pharmaceutical engineering.

Dicentrine；Extraction and purification；Chemistry of natural medicine；Pharmaceutical engineering

G642.0

A

1673-7210（2016）01（b）-0167-03

2015-10-13本文编辑：程铭）

云南省高校本科教学质量与教学改革工程项目（2013）。

蔡乐（1977-），男，博士，副教授；研究方向：天然产物化学。