丙酮酸乙酯对缺氧缺血性脑损伤仔鼠海马区caspase-3表达及学习记忆能力影响①

曹　阳，张丽华

丙酮酸乙酯对缺氧缺血性脑损伤仔鼠海马区caspase-3表达及学习记忆能力影响①

曹阳1，张丽华2

目的探讨丙酮酸乙酯（EP）对新生大鼠缺氧缺血脑损伤（HIBD）后海马区caspase-3表达及学习记忆能力影响。方法7日龄Wistar大鼠90只随机分假手术组（n=15）、HIBD组（n=15）、EP1组（n=15，10 ml/kg）、EP2组（n=15，30 mg/kg）、EP3组（n=15，50 mg/kg）和EP4组（n=15，100 mg/kg）。采用经典Rice法制备模型。EP各组于术前30 min及术后每24小时腹腔注射相应剂量EP，共2周。免疫组化染色观察caspase-3阳性细胞数，Morris水迷宫评测逃避潜伏时间和穿过目标象限次数。结果除EP1组caspase-3阳性细胞数与HIBD组无显著性差异（P＞0.05）外，其余EP各组较HIBD组均明显减少（P＜0.01），EP3组最少（P＜0.01）。Morris水迷宫测试：除EP1组逃避潜伏期、穿过目标象限次数与HIBD组无显著性差异（P＞0.05）外，其余EP各组均优于HIBD组（P＜0.01），EP3组最佳（P＜0.01）。结论EP可以减少HIBD大鼠海马区caspase-3的表达，改善HIBD引起的远期学习记忆能力障碍。

缺氧缺血性脑损伤；丙酮酸乙酯；caspase-3；学习记忆能力；大鼠

［本文著录格式］曹阳，张丽华.丙酮酸乙酯对缺氧缺血性脑损伤仔鼠海马区caspase-3表达及学习记忆能力影响［J］.中国康复理论与实践，2016，22（4）：409-412.

CITED AS：Cao Y，Zhang LH.Effect of ethyl pyruvate on expression of caspase-3 in hippocampus and learning and memory in rats with hypoxic ischemic brain damage［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：409-412.

新生儿缺氧缺血性脑损伤（hypoxic ischemic brain damage，HIBD）是围生期新生儿因缺氧引起的脑部病变，可能造成神经元和脑白质的损伤，并且在大脑的发育过程中形成极具破坏性的伤害［1］。HIBD是导致新生儿死亡的重要原因之一，也是引起小儿脑瘫的重要原因之一［2-3］。有证据表明，在美国HIBD的发病率已由2‰～3‰上升到6‰，不发达国家发病率甚至高达26‰［4-6］。尽管医疗科学技术有了飞速的发展，人们对胎儿和新生儿的病症有了更多的了解，但是对于HIBD仍然没有一种明确、有效的疗法。因此，寻找一种明确有效的药物对HIBD的治疗仍十分重要。大量的动物实验证明，丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate，EP）可通过改善由氧化反应介导的细胞损伤，减少细胞炎症因子的分泌，抑制细胞凋亡，对许多内脏器官起到保护作用［7-8］。本研究通过大鼠HIBD模型，探讨EP对HIBD新生大鼠脑海马区caspase-3表达及学习记忆能力的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物

7日龄Wistar大鼠90只，雄性47只，雌性43只，体质量10～14 g，清洁级，由佳木斯大学动物实验室提供，动物合格证号：SCXIL（黑）2013-001。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组（n=15）、HIBD模型组（n=15）、EP1组（n=15）、EP2组（n=15）、EP3组（n=15）和EP4组（n=15）。

1.2试剂及仪器

兔抗大鼠IgG蛋白、山羊抗兔IgG蛋白：北京奥博森生物技术有限公司。CH30光学显微镜：日本OLYMPUS。

1.3模型制备

采用经典Rice法［9］进行模型制备。大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液3 ml/kg麻醉，仰卧位固定于实验台上，在颈部正中位纵向切开一道长1～2 cm的切口，找到左侧颈总动脉，将其游离并于近心端处永久性结扎，将大鼠创口缝合后放回笼中休息2.5～3 h，待苏醒后再放入37℃恒温的密闭箱内，并向箱中通入8%氧气和92%氮气的混合气体2 h，流量保持在1.5～2 L/ min。将缺氧后的大鼠送回原笼中，由母鼠继续喂养。

1.4干预方法

假手术组：只将左侧颈总动脉分离，不结扎，不进行缺氧处理。

HIBD组：结扎左侧颈总动脉，进行缺氧处理，生理盐水10 ml/kg注射。

EP1、EP2、EP3、EP4组：首先结扎左侧颈总动脉，缺氧处理，术前30 min及术后每24小时分别腹腔注射EP 10 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/ kg，持续2周。

按随机数字表法在每组中抽取5只大鼠处死，取脑、切片，行免疫组化染色。余下大鼠进行连续4 d的Morris水迷宫训练。

1.5免疫组化染色

干预2周后，每组大鼠随机取出5只，心脏灌注处死，并做脑冠状切片，厚度8 μm。切片浸入3% H2O2去离子水中30 min，5%山羊血清封闭液封闭1 h。滴加一抗caspase-3抗体（兔抗大鼠IgG蛋白，1∶ 100），4℃孵育过夜，滴加二抗（山羊抗兔IgG蛋白1∶200），37℃恒温水浴箱孵育1 h。室温环境下，DAB显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。若镜下细胞质或细胞核内有棕黄色的颗粒，则视其为阳性细胞，若无棕黄色颗粒，则视其为阴性细胞［10］。每个标本取3张切片在100倍镜下观察，每张切片取4个视野对阳性细胞进行计数，计算平均值。

1.6 Morris水迷宫测定

将Morris水迷宫的水池平均划分为4个象限，在其中1个象限中央设置一个略高于水面的平台，并将此象限作为平台象限。

1.6.1定位航行实验

每天上午10时，将每组剩余大鼠依次从4个象限的入水点放入迷宫，记录其逃避潜伏时间，即从大鼠头朝池壁被放入水池开始，到四肢全部爬上平台所消耗的时间，120 s/次，4次/d，间隔20 min，连续训练4 d，记录第4天的训练结果。

1.6.2空间探索实验

训练第5天，将水面的平台撤走，将大鼠头朝池壁放入水池中，并对120 s内大鼠穿过平台原来所在象限的次数进行记录。

1.7统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行分析。数据采用（x¯±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。显著性水平α= 0.05。

2　结果

2.1 caspase-3阳性细胞情况

假手术组caspase-3阳性细胞数目与其余各组比较均存在非常显著性差异（P＜0.01）。各组大鼠两两进行比较后发现，EP1组阳性细胞数目与HIBD组之间无显著性差异（P＞0.05）；其余各组之间均存在非常显著性差异（P＜0.01）。EP3组caspase-3阳性细胞数最少，抑制凋亡效果在6个组中最为明显。见表1、图1。

2.2 Morris水迷宫测试

假手术组大鼠逃避潜伏时间明显短于其他各组（P＜0.01）。除EP1组与HIBD组逃避潜伏时间无显著性差异（P＞0.05）外，EP2组、EP3组和EP4组均明显短于HIBD组（P＜0.01）。按时间长短排列：假手术组＜EP3组＜EP4组＜EP2组＜EP1组≤HIBD组。

假手术组大鼠穿过目标象限次数明显多于其他各组（P＜0.01）。除EP1组与HIBD组穿过目标象限次数无显著性差异（P＞0.05）外，EP2组、EP3组和EP4组均明显多于HIBD组（P＜0.01）。按照次数多少排列：假手术组＞EP3组＞EP4组＞EP2组＞EP1组≥HIBD组。

图1　各组caspase-3阳性表达（免疫组化染色，100×）

表1　各组caspase-3阳性细胞数（个/视野）

表2　各组逃避潜伏时间、穿过目标象限次数

3　讨论

HIBD是急性、未知的围产期窒息所导致的新生儿期较为常见的一种神经系统损伤性疾病［11］。已有大量的研究证实，大脑供血的不足甚至终断可导致脑组织氧气和葡萄糖的缺乏，并触发级联性生化反应的发生，如能量的消耗、酸中毒、兴奋性中毒、细胞内钙离子大量积聚，以及氧化应激反应、炎症反应、细胞凋亡和脑组织的大面积损伤，损伤部位包括大脑皮层、纹状体、海马体等［12-16］。海马体又被称为海马区，其主要作用为学习、记忆和空间定位等，是人类用以处理长期学习、记忆的主要区域，而贫血、缺氧等状态都容易使海马区受到不同程度的损伤［17］。caspase-3是细胞凋亡过程的主要执行者，已被了解的caspase-3底物几乎都能被其水解［18］。在CD95抗体、CD3抗体、地塞米松、星形孢菌素诱导的凋亡实验中，caspase-3缺陷小鼠的脑发育受到显著影响，证明caspase-3在大脑的发育过程中也发挥了不可忽视的作用［19-21］。

本实验通过采用经典的Rice法制备HIBD模型，该模型价格低廉，成功率也相对较高，并且制作较为容易，为新生儿缺氧缺血性脑损伤的药物治疗研究打下基础。本研究显示，HIBD组海马区caspase-3阳性细胞数目明显增加，且在水迷宫测试中，HIBD组大鼠的学习记忆能力明显下降，提示模型建立成功。

已有研究显示，EP对于脑组织损伤具有保护作用，能够有效抑制凋亡细胞的发生［22-24］。在本研究中，经过EP治疗后的HIBD大鼠脑海马区caspase-3阳性细胞的数目较未经治疗的HIBD大鼠明显减少，这一结果也证实了EP的神经保护作用。

目前，在关于大鼠的空间、位置学习记忆能力的研究中，Morris水迷宫测试已被广泛应用［25］。定位航行和空间探索实验已经证实海马细胞是空间记忆能力的基础［26］。

通过对不同剂量EP组caspase-3阳性细胞数目的对比，发现药量为30 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg，对HIBD大鼠脑海马区均有保护作用，并且这种保护作用具有剂量依赖性。药量为10 mg/kg时，不具备明显的保护作用。随着剂量不断增加，30 mg/kg时，有明显的保护作用；50 mg/kg时，保护作用最大；100 mg/kg时，保护作用明显，却较50 mg/kg略差。

综上所述，EP可以改善新生儿期脑缺氧缺血造成的学习记忆障碍，该作用与其抑制海马区凋亡蛋白caspase-3的表达有关，且EP的治疗效果具有剂量依赖性。目前EP仅适用于动物实验中，它的安全、有效性仍有待研究。

［1］郑少茹.新生儿缺氧缺血性脑病研究现状及进展［J］.中国医药科学，2015（1）：72-74

［2］钟乐，王霞，于小河，等.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后的远期行为学测试［J］.中国当代儿科杂志，2005，7（3）：245-248.

［3］Burton VJ，Gerner G，Cristofalo E，et al.A pilot cohort study of cerebral autoregulation and 2-year neurodevelopmental outcomes in neonates with hypoxic-ischemic encephalopathy who received therapeutic hypothermia［J］.BMC Neurol，2015，10（15）：209

［4］Logitharajah P，Rutherford MA，Cowan FM.Hypoxic-ischemic encephalopathy in preterm infants：Antecedent factors，brain imaging，and outcome［J］.Pediatr Res，2009，66（2）：222-229

［5］Douglas-Escobar M，Weiss MD.Hypoxic-ischemic encephalopathy：A review for the clinician［J］.JAMA Pediatr，2015，169（4）：397-403.

［6］Davidson JO，Wassink G，van den Heuij G，et al.Therapeutic hypothermia for neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy-where to from here？［J］.Front Neurol，2015，14（6）：198.

［7］欧阳颖，苏浩彬，薛红漫，等.丙酮酸乙酯对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织的保护作用［J］.中国病理生理杂志，2013，29（7）：1181-1185.

［8］Shen H，Hu X，Liu C，et al.Ethyl pyruvate protects against hypoxic-ischemic brain injury via anti-cell death and anti-inflammatory mechanisms［J］.Neurobiol Dis，2010，37（3）：711-722.

［9］Wang IC，Liu HT，Yu CM，et al.Effect of hyperbaric oxygenation on intertebral disc degeneration：an in vivo study with sprague-dawley rats［J］.Spine，2013，38（3）：E137-E142.

［10］张慧，尹琳，刘丽梅，等.脑缺血后处理对大鼠海马Caspase-3表达的影响［J］.中国实用神经疾病杂志，2010，13（9）：8-10

［11］Dixon BJ，Reis C，Ho WM，et al.Neuroprotective strategies after neonatal hypoxic ischemic encephalopathy［J］.Int J Mol Sci，2015，16（9）：22368-22401.

［12］Zalewska T，Jaworska J，Ziemka-Nalecz M.Current and experimental pharmacological approaches in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy［J］.Curr Pharm Des，2015，21（11）：1433-1439.

［13］Arteaqa O，Revuelta M，Uriquen L，et al.Pretreatment with resveratrol prevents neuronal injury and cognitive deficits induced by perinatal hypoxia-ischemia in rats［J］.PLoS One，2015，10（11）：eo142424.

［14］Lu Q，Harris VA，Kumar S，et al.Autophagy in neoatal hypoxia ischemic brain is associated with oxidative stress［J］.Redox Biol，2015，10（6）：516-523.

［15］张雨平，赵聪敏，奚敏，等.缺氧缺血对新生鼠Caspase-3效应蛋白酶及细胞凋亡的影响［J］.中国临床康复，2005，9（3）：192-193.

［16］初桂兰，李维超.缺氧缺血后新生鼠脑组织Caspase-3mRNA表达变化及其意义［J］.小儿急救医学，2005，12（1）：31-33.

［17］欧阳福连，周细中，方素珍，等.新生大鼠缺氧缺血性脑损伤远期行为学和超微结构改变［J］.中国当代儿科杂志，2012，14（5）：380-384.

［18］齐登斌，郑辑英，李光来，等.丙酮酸乙酯对癫痫持续状态大鼠神经元凋亡及XIAP、Caspase-3表达的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2011，9（1）：81-82.

［19］王筱冰，张小翠，夏妙红，等.Caspase的活化机制［J］.现代生物医学进展，2006，6（3）：53-55.

［20］Wang P，Wang L，Wang S，et al.Effects of calcium-sensing receptors on apotposis in rat hippocampus during hypoxia/reoxygenation through the ERK1/2 pathway［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（9）：10808-10815.

［21］杨梅，林丽星，王浩，等.缺氧缺血性脑病新生儿体液免疫功能的变化及其影响因素［J］.实用儿科临床杂志，2009，24（2）：119-120.

［22］孔祥颖，李晓捷，宋福祥，等.丙酮酸乙酯对宫内感染致脑损伤新生仔鼠12-脂氧合酶表达和细胞凋亡的影响［J］.中国儿童保健杂志，2015，23（8）：817-820.

［23］Shin JH，Lee HK，Lee HB，et al.Ethyl pyruvate inhibits HMGB1 phosphorylation and secretion in activated microglia and in the postischemic brain［J］.Neurosci Lett，2014，13（558）：159-163.

［24］王浩，何义舟，罗哲，等.丙酮酸乙酯对肝细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制研究［J］.中国临床医学，2015，22（2）：195-198.

［25］武海霞，吴志刚，刘红彬，等.Morris水迷宫实验评在空间学习记忆中的应用［J］.神经药理学报，2014，4（5）：30-35.

［26］方松.Morris水迷宫实验中海马相关空间学习记忆的研究进展［J］.国际病理科学与临床杂志，2010，30（4）：321-326.

Effect of Ethyl Pyruvate on Expression of Caspase-3 in Hippocampus and Learning and Memory in Rats with Hypoxic Ischemic Brain Damage

CAO Yang1，ZHANG Li-hua2
1.Rehabilitation College of Jiamusi University，Jiamusi，Heilongjiang 154000，China；2.Department 2 of Cerebral Palsy，The ThirdAffiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi，Heilongjiang 154000，China
Correspondence to ZHANG Li-hua.E-mail：zhanglihua59597@163.com

Objective To investigate the effect of ethyl pyruvate（EP）on the expression of caspase-3 in the hippocampus and the learning and memory ability in neonatal rats with hypoxic ischemic brain damage（HIBD）.Methods 90 Wistar rats of 7 days old were randomly divided into sham operation group（n=15），HIBD group（n=15），EP1 group（n=15，10 ml/kg），EP2 group（n=15，30 mg/kg），EP3 group（n= 15，50 mg/kg）and EP4 group（n=15，100 mg/kg）.The model was established with Rice's method.30 minutes before operation，and every 24 hours after operation，EP groups were injected with 10 ml/kg，30 mg/kg，50 mg/kg，100 mg/kg EP in abdomen respectively，for 2 weeks.After treatment，the caspase-3 positive cells were observed by immunohistochemical staining，and the latency and the times crossing the target quadrant were tested by Morris water maze test.Results The caspase-3 positive cells were less in EP groups than in HIBD group（P＜0.05），expect EP1 group（P＞0.05），especially in EP3 group（P＜0.01）.The latency and the times crossing the target quadrant were better in EP groups than in HIBD group（P＜0.05），expect EP1 group（P＞0.05），especially in EP3 group（P＜0.01）.Conclusion Ethyl pyruvate can decrease the expression of caspase-3 in hippocampus，and improve the ability of memory and learning in neonatal rats with HIBD.

hypoxic ischemic brain damage；ethyl pyruvate；caspase-3；learning and memory；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.008

R743

A

1006-9771（2016）04-0409-04

佳木斯大学研究生科技创新项目（No.LM2015-053）。

1.佳木斯大学康复医学院，黑龙江佳木斯市154000；2.佳木斯大学附属第三医院脑瘫康复二科，黑龙江佳木斯市154000。作者简介：曹阳（1989-），女，汉族，黑龙江齐齐哈尔市人，硕士研究生，主要研究方向：小儿脑瘫的综合康复。通讯作者：张丽华，女，汉族，黑龙江佳木斯市人，教授，主任医师，主要研究方向：小儿脑瘫的综合康复。E-mail：zhanglihua59597@163.com。

（2015-11-16

2016-01-05）