在体大鼠脑部核团的微电极记录偶联行为学康复实验模型方法的建立①

张晟豪，李　楠，葛顺楠，李　洋，武松燕，王学廉，刘朝晖

在体大鼠脑部核团的微电极记录偶联行为学康复实验模型方法的建立①

张晟豪1a，李楠1a，葛顺楠1a，李洋1a，武松燕1b，王学廉1a，刘朝晖1b

目的建立在体大鼠脑部核团的微电极记录及行为学偶联模型。方法将大鼠背部留置管连接固定装置改进后置于大鼠背部皮下，为大鼠的相关脑部核团埋置阵列微丝电极，将神经电生理采集系统与自身给药行为学系统进行信号对接，通过自身给药训练使大鼠成瘾，在大鼠成瘾的不同状态下进行相关脑部核团的电生理信号记录。结果与结论经过改进后的留置管连接固定装置有较好的性能，脱管漏管的现象大幅度降低，自身给药系统与电生理采集系统对接后信号传输稳定，实现了大鼠脑部相关核团在自身给药行为发生过程中的神经电生理信号的同步采集。

微电极记录；自身给药；脑功能；康复；神经生理

［本文著录格式］张晟豪，李楠，葛顺楠，等.在体大鼠脑部核团的微电极记录偶联行为学康复实验模型方法的建立［J］.中国康复理论与实践，2016，22（4）：399-403.

CITED AS：Zhang SH，Li N，Ge SN，et al.Establishment of a model in rat brain nuclei microelectrode recording coupled behavioristics for rehabilitation experiment［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（4）：399-403.

目前自身给药［1］模型主要应用于成瘾［2］药物特性研究，或被动给予抗成瘾药物，以观察此种药物对药物依赖［3］行为的影响。脑部核团的电生理记录可以研究脑区的功能变化，将自身给药模型与电生理采集偶联起来，在大鼠做出药物依赖觅药［4］行为的同时记录其相关脑区的电生理活动特征，从而分析相关脑区电生理功能在觅药行为前后的变化情况。目前神经功能康复［5］是临床和科研的研究热点，本偶联模型基于药物成瘾对神经功能的影响，开拓了研究神经功能康复的新手段。

传统动物行为学配合脑电生理的记录时，动物行为［6］发生的标记点是通过回放视频资料来确定行为产生的具体时间，这样既需要耗费大量时间去观察寻找标记点，又会因为记录的视频信号和实际行为的时间差等问题，以及肉眼观察本身带来的误差问题造成标记行为学时间点不准确，从而对实验结果产生影响以及造成实验过程的繁琐。本偶联模型很好地解决了上述问题，动物行为学的标记点通过动物自身自行触发而产生，在后期分析时就避免了需要回放行为学视频和手工标记不准确的问题。此偶联模型建立的难点是如何在电生理信号采集的过程中同步记录到动物行为学的发生信号，由于自身给药训练笼实验模块（如鼻触等）的输出信号都是0/+3.3 V的TTL（transistor transistor logic）电平信号［7］，这就为神经电生理信号采集系统识别输入标记信号提供了可能。本实验通过这一点将动物行为学与电生理采集融合在一起。

1　实验动物

清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量300～330 g，由第四军医大学实验动物中心提供。

埋置用阵列微电极（16通道，阵列微丝电极：4× 4，电极丝间距200 μm，参比电极间距400 μm，L1= 6 mm，L2=9 mm），由苏州格罗贝尔公司提供。

自身给药相关材料和装置：①输液系统，包括硅胶管SIL-1006、输液管PE-1106和输液滑环；②大鼠静脉自身给药行为实验笼，配备2个鼻触，1个笼灯，1个静脉输液泵；大鼠在实验过程中全部数据由配套软件进行记录分析；③颈静脉留置管连接固定装置。均购自宁波安来公司。

电极埋置配套设备：①大鼠头部立体定位仪；②牙科钻。均购置于深圳瑞沃德公司。

神经电生理信号采集设备，购自美国NEURONEXUS公司。

2　方法

2.1颈外静脉置管术

2.1.1分离静脉

大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉成功后右侧颈部备皮，取仰卧位，在右侧锁骨中线上缘剪一个2 cm长纵行切口，钝性分离皮下组织，游离右侧颈外静脉，整个过程可适当滴少量盐水，防止干燥。

2.1.2插入留置管

用2根0号线穿过颈外静脉分别置于远心端和近心端方向以备结扎和固定用，将2 ml注射器针帽垫于颈外静脉下使血管处于弧形隆起位置，结扎远心端，用50 ml注射器针头从静脉上部刺入静脉，左手用镊子略微提起破口上缘，右手用镊子夹住之前做好的静脉留置管，沿破口插入约3.5～4 cm至心房入口处，回抽有暗红色血液，推注液体无阻力证明管道置入成功。结扎固定插管，将圈结缝在血管旁边的肌肉上，线圈要稍宽松，能防止置管被大鼠拽出即可，过紧会使肌肉坏死。

2.1.3打皮下隧道，植入留置管连接固定装置及缝合

将大鼠背部肩胛间的皮肤剪一个长2.5 cm的纵行切口，钝性扩大皮下空间，用穿刺针从颈部切口到背部切口打一皮下隧道，将留置管从隧道穿出大鼠背部切口与固定装置的不锈钢导管弯折处相连，通过固定装置注入青霉素20万U，用堵头套在固定装置不锈钢导管上端，将固定装置尼龙网片部分埋置于大鼠皮下。消毒，缝合切口。将大鼠放入单笼饲养，保温至其苏醒（图1）。

图1　颈外静脉留置管连接固定器植入成功后的大鼠

2.1.4术后维护

术后大鼠常规饲养3 d，每天从静脉置管注入青霉素20万U预防因感染和异物植入而引起的静脉炎和全身感染，同时也可以起到冲刷置管的作用。当冲管发现压力增高时，可用适量肝素冲管。

2.2脑部核团电极植入术（以植入阵列微丝电极［8］至伏隔核为例）

2.2.1暴露骨窗

将大鼠用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，消毒并进行头部备皮，将大鼠头部固定于立体定位仪，沿大鼠头部中线剪一个长2 cm切口，去除骨膜，剪掉切口旁多余皮缘，暴露前囱和后囱。

2.2.2定位并植入电极

根据伏隔核在大鼠脑定位图谱上的坐标位置（AP+ 2.0 mm，ML+/-1.2 mm），在颅骨上进行标记。以标记点为中心用牙科钻打磨出2×2 mm的矩形骨瓣，摘除骨瓣后用1 ml注射器针头挑去硬脑膜暴露大脑表面，在头骨其他位置选取4个点（尽量分布均匀）以备固定颅钉之用，用牙科钻（选取1.1 mm直径的钻头）穿透后将颅钉垂直拧入洞口，深度以刚达到大脑表面为准。将电极的两根地线分别绕在两个颅钉上，通过立体定位仪将电极的中心调整至伏隔核的坐标位置，缓慢植入电极，根据坐标数字显示器控制植入深度与速度，大约控制在平均10 μm/s的植入速度为宜，一边深入电极尖端，一边用生理盐水溶解包绕在电极丝周围的聚四氟乙烯（起到电极丝固定的作用），但不能溶解得过快，以包绕物底部距离大脑表面1 mm为宜。

2.2.3包埋固定电极

当电极植入到6.7 mm左右的深度后停止，吹干颅骨表面，将牙科水泥拌好后均匀覆盖到颅骨表面以刚淹没颅钉为宜；待其变硬后，将电极接口处调整至大鼠头部中央位置，用牙科水泥［9］进行包埋，包埋高度以距离接口边缘2 mm为宜；待其变硬后，剪取两根3 cm左右的棉签棒，用万能胶粘于电极接口两侧以备在体训练电极的连接固定用。消毒创口，将大鼠放入单笼饲养，保温至其苏醒（图2）。

2.2.4术后处理

术后大鼠常规饲养4 d，每天从静脉留置管注入青霉素20万U以预防感染，并起到维护留置管通畅的作用。

2.3自身给药笼与电生理采集设备的连接

将并联排线接于自身给药笼各模块的信号输出端，通过并联排线分线的方式分别接于各自的BNC插头，将对应的BNC插头［10］分别接于电生理采集设备的Input接口，打开电生理记录软件中相应的Input通道，触碰鼻触以及运行笼灯和输液泵，观察信号输入。在观察到信号能正常输入后，将相应通道的原始名称分别与各自对应输入模块的名称进行重新命名。

2.4大鼠自身给药训练与神经电生理信号记录的偶联

大鼠脑部核团电生理信号采集与颈外静脉自身给药相偶联（图3左）。行为学的给药记录与大鼠脑深部核团的电生理信号同步采集（图3右）。

图2　脑部核团微电极埋置成功后的大鼠

图3　大鼠自身给药训练与神经电生理信号记录的偶联

2.4.1自身给药笼的屏蔽处理

将自身给药笼底壁用导电布（抗腐蚀效果好）粘附完全，将内侧壁和顶壁用导电布或铜箔等电导效果好的材料做相同粘附处理，必须使自身给药笼内部6个面的电导材料连通成一体，且需将电生理采集设备与自身给药笼底壁导电布用导线相接（使笼内物体与电生理采集设备共电势）。将自身给药笼的外部也做相同处理，使各面相连通，但内部与外部要保持绝缘。

2.4.2空白电生理行为学记录

自电极埋置术后第5天起将大鼠放入自身给药笼，连接上头部电极后，通过电极上的棉签棒用扎带或橡皮筋将电极与电极连接器相固定，但不连接背部给药装置。加载FR1［11］（Fixed Radio，1∶1）模式的自身给药训练程序；FR1模式即大鼠触碰1次有效鼻触，允许药物注射1次。每次注射后20 s内为不应期，程序开始时笼灯亮起，输液泵注射时以及后续的不应期内笼灯熄灭，不应期过后笼灯重新亮起进入下一个循环，设定的训练期内输液泵的给药上限为50次，在训练时间内如果给药达到50次后程序自动终止，如未达到则程序运行到时间终点为止；运行电生理记录软件，调整好参数后开始记录大鼠脑电信号，开始记录10 s后运行FR1程序，直到程序结束。观察分析大鼠行为事件相关的脑电信号。由于此时大鼠未经任何给药训练，所以触碰有效鼻触的次数极其不稳定，一般给药FR1的程序运行时间设定为2 h，为了能获得更多事件行为相关数据可以延长程序运行时间但不要超过12 h（自身给药笼中大鼠不能进食和饮水）。

2.4.3药物成瘾训练以及成瘾相关行为事件的电生理记录

将大鼠背部的留置管固定装置与输液泵相连并运行FR1程序，运行时间2 h。由于大鼠还未建立触碰有效鼻触以获得药物的条件反射，所以需要减少大鼠的每日食物摄取量（减少至每日15 g左右）。训练开始时放置食物至有效鼻触位置，30 min内无有效鼻触触碰则自动给予药物注射1次，以引导大鼠建立，引导训练时间为3 d。

第4天开始进入正式训练阶段，去除引导手段，此时正式记录训练数据以分析大鼠的成瘾行为学建立情况。以大鼠连续3 d的给药次数不超过此3 d给药次数均值的10%为成瘾训练成功的标志［12］。以下为1只可卡因自身给药大鼠训练成功的鼻触图（图4），此图反映了大鼠已经完全建立了触碰有效鼻触以获取药物的条件反射（给药剂量为0.7 mg/kg/inf）。

在其训练成功后将大鼠头部电极与电极连接器相接，用上述相同方法固定，将大鼠背部固定装置与输液泵相通，运行电生理采集系统软件记录电生理信号10 s之后（由于有效鼻触的不应期为20 s［13］）运行FR1程序2 h，结束运行后分析实验相关数据。

图4　大鼠可卡因自身给药建模成功后有效/无效鼻触触碰统计

2.4.4条件线索引燃［14］的电生理行为学记录

大鼠完全戒断成瘾药物14 d后再次将大鼠放入自身给药笼中，只连接头部电极，不连接给药装置，开始记录电生理信号10 s后运行FR1程序2 h，运行结束后分析实验相关数据。由于大鼠已经形成了触碰鼻触以获取药物的条件反射，程序开始运行的标志是笼灯亮起，虽然经过长时间的戒断但当程序开始运行笼灯亮起时，大鼠依然会很快去触碰有效鼻触以求获取药物，但却得不到药物输入，当大鼠无法得到药物带来的欣快感时会连续尝试触碰有效鼻触以求获取药物，但在不应期内大鼠几乎不会触碰有效鼻触，这就反映了输液泵运行时发出的声音也是重要的条件线索。

3　讨论

本实验通过行为学事件信号的引入将大鼠静脉自身给药系统与电生理采集系统进行对接，实现特定脑区的电生理记录和动物给药行为的相互偶联，通过药物的正性强化［15］作用，使动物建立起行为与奖赏之间的联系，从而使动物通过自身行为主动获取药物，在产生觅药行为的同时记录其相关脑区的电生理功能，因其较好地模拟了人类的用药行为，故该模型是研究药物依赖［16］行为学与脑功能［17］相互之间联系的重要纽带。国内有通过向大鼠脑部植入电极后施以恐惧电击［18］，经过数日的恐惧建模［19］后记录大鼠脑电生理的变化以研究大鼠在恐惧时相关脑区的电生理状态。国外有通过大鼠自身给药行为学与特定脑区微量透析相结合［20］研究相关脑区生化［21］成分的变化情况。虽然这些研究都有行为学与实验干预因素相结合的情况，但都没有实现真正意义上的大鼠行为学事件与电生理信号采集的自主同步记录与研究。

本偶联模型的创新点是完全通过动物自身自主进行行为学与电生理采集的同步进行，无任何被动的人为因素，更能客观地反映实验结果。虽然本实验只是通过大鼠静脉自身给药系统与电生理采集系统相偶联做出说明，但由于此自身给药训练笼是开元化模块，可以根据实验设计的不同自行增加或减少相关行为学装置以及干预设备以满足不同的实验需要，在康复模型应用方面可以加入红外［22］、中频电［23］、次声［24］以及电磁场［25］等物理因子［26］，以观察这些物理因子在治疗相关模型大鼠疾病过程中特定脑区的电生理功能是否发生改变，并且如何改变。因此偶联模型可全程在大鼠清醒状态下完成治疗干预与实验相关脑区的电生理同步记录，可以更及时有效地反映治疗干预因素在整个疾病过程中发挥的作用，尤其是在偏瘫［27］、肌张力障碍［28］等康复相关模型大鼠的物理治疗干预对其相关运动功能区［29］的影响变化，以及在康复过程中相关脑区电生理功能连续性变化的研究方面提供了有效途径。

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Establishment of A Model in Rat Brain Nuclei Microelectrode Recording Coupled Behavioristics for Rehabilitation Experiment

ZHANG Sheng-hao1a，LI Nan1a，GE Shun-nan1a，LI Yang1a，WU Song-yan1b，WANG Xue-lian1a，LIU Chao-hui1b
1.a.Department of Neurosurgery；b.Rehabilitation Department，Tangdu Hospital，the Forth Military Medical University，Xi'an，Shaanxi 710038，China
Correspondence to WANG Xue-lian，LIU Chao-hui.E-mail：531069242@qq.com（WANG Xue-lian）；623364237@qq.com（LIU Chao-hui）

Objective To establish a coupled model combining the rat brain nuclei microelectrode recordings and the behavioristics for rehabilitation experiment.Methods The modified indwelling tube connection fixed device was put inside the rats'back，and the microprobes were implanted into related neural nucleus.A signal connection was made between self-administration system and electrophysiological data acquisition system.The rat was addicted after training by self-administration system.The related cerebral nucleus electrophysiological signals were recorded in different states of addiction.Results and Conclusion The modified indwelling tube connection fixed device has a better quality for reducing the phenomenon of leak.The signal was well in the combination of two different systems.The signals for the rat's action and neural electrical were recorded in the same time.

microprobe recording；self-administration；cerebral function；rehabilitation；neurophysiology

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.04.006

R749.6

A

1006-9771（2016）04-0399-05

国家自然科学基金青年科学基金项目（No.81301179；No.81401104）。

1.第四军医大学唐都医院，a.神经外科；b.康复医学科，陕西西安市710038。作者简介：张晟豪（1990-），男，汉族，陕西西安市人，硕士研究生，主要研究方向：药物依赖和神经电生理。通讯作者：王学廉（1963-），男，汉族，陕西西安市人，博士，教授，主要研究方向：脑功能疾病。刘朝晖（1962-），女，汉族，山西运城市人，博士，副教授，主要研究方向：脑功能康复。E-mail：531069242@qq.com（王学廉）、623364237@qq.com（刘朝晖）。

（2015-11-11

2015-12-21）