鸡新城疫病毒(NDV-XX08)单克隆抗体的制备与鉴定

银梅,孔令芸,张秋雨,丰兰竹,周洁,岳锋,王选年

(1.河南科技学院动物科学学院,河南新乡453003;2.新乡学院生命科学技术学院,河南新乡453003;3.新乡市红旗区动物疫病预防控制中心,河南新乡453003)

调查研究

鸡新城疫病毒(NDV-XX08)单克隆抗体的制备与鉴定

银梅1,孔令芸1,张秋雨1,丰兰竹3,周洁1,岳锋2,王选年2

(1.河南科技学院动物科学学院,河南新乡453003;2.新乡学院生命科学技术学院,河南新乡453003;3.新乡市红旗区动物疫病预防控制中心,河南新乡453003)

本研究采用鸡胚繁殖NDV-XX08,差速离心法纯化NDV,用纯化的病毒免疫BALB/c小鼠.取免疫小鼠的脾细胞与NS0细胞进行融合,用间接ELISA和血凝抑制试验(HI)进行筛选,挑选效价高的杂交瘤细胞进行克隆和亚克隆,建立阳性杂交瘤细胞株,最终得到一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,命名为4F12.采用体外细胞培养和体内诱生腹水的方法制备了其McAb.对获得的单克隆抗体采用ELISA,HI,Western-Blotting方法进行鉴定.杂交瘤细胞培养上清和腹水的ELISA效价分别为1∶160和1∶3.2X104.获得的单克隆抗体与NDV具有良好的特异性反应,与鸡胚阴性尿囊液、鸡正常组织、鸡IgG、鸡传染性囊病病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽流感检测抗原均无交叉反应性.HI试验表明,制备的单抗没有血凝抑制活性.Western-Blotting证明获得的单抗与新城疫病毒蛋白有特异性反应.经连续传代20次,冻存、复苏3次,4F12杂交瘤细胞株仍能稳定分泌抗体.

鸡;新城疫病毒;单克隆抗体;Western-Blotting

鸡新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起禽类的一种急性传染病,是对养鸡业危害最大的传染病之一.NDV属于禽腮腺炎病毒属,只有一个血清型,但各毒株间的毒力和对鸡的致病性有很大差异,常规的血凝抑制试验不易检测出抗原结构的差异.单克隆抗体具有识别单个抗原决定簇的特异性.在ND诊断上,应用单克隆抗体可以检测不同NDV毒株间表面抗原结构的差异,具有快速、灵敏和特异性强的优点,因此利用单抗建立ND诊断的报道也越来越多.如卢建红等[1]利用抗NDV单抗建立了PEG-ELISA技术,庄向生等[2]利用NDV单抗建立了DFA技术.本试验用新乡地方株新城疫病毒NDV-XX08作为抗原,通过细胞杂交技术制备抗NDV的单克隆抗体,并对单抗的特异性进行了鉴定,为进一步NDV生物学特性的研究及快速诊断方法的建立奠定基础.

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物和细胞BALB/c小鼠(6-8周龄),购自郑州大学医学院;小鼠NS0细胞,由本实验室提供;9日龄SPF鸡胚,购自梅里亚维通实验动物技术有限公司.

1.1.2主要试剂和病毒PEG-1500(聚乙二醇), Sigma公司;IFA(弗氏不完全佐剂)、CFA(弗氏完全佐剂),Pierce公司.鸡新城疫病毒(NDVXX08)本实验室分离保存.

1.2方法

1.2.1病毒的繁殖与纯化采用鸡胚尿囊腔接种病毒的方法繁殖NDV-XX08,将NDV-XX08尿囊液在4℃条件下采用差速离心法进行纯化.将100 mL尿囊液依次3 000 r/min离心10 min,5 000 r/min离心10 min,6 000 r/min离心10 min;取上清,再15 000 r/min离心2.5 h;取沉淀,用0.5 mL生理盐水悬浮,检测其280 nm处的吸光值,并计算病毒蛋白含量,-20℃保存备用.

1.2.2免疫小鼠取6周龄雌性BALB/c小鼠,将纯化的NDV与佐剂完全乳化免疫,免疫剂量为50～100 μg/只.首免用弗氏完全佐剂(CFA);加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA).加强免疫3次,每次间隔14 d.最后1次免疫第10天,检测抗体水平,抗体效价符合要求的小鼠,在融合前3 d,尾静脉注入50 μg不加佐剂的抗原进行超强免疫.

1.2.3ELISA筛选方法的建立先固定NDV抗原的浓度,将BALB/c小鼠阳性血清作倍比稀释,读取OD450nm值,确定抗血清的最佳工作浓度,然后在抗血清最佳工作浓度下,确定抗原的最佳工作浓度.

1.2.4小鼠血清效价的测定将免疫小鼠断尾采血,分别用间接ELISA和HI试验检测抗体效价.

1.2.5杂交瘤细胞株的建立取抗体水平符合融合要求的免疫BALB/c小鼠,处死,取脾细胞,与NS0细胞融合,融合剂为PEG-1500,融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,100 μL/孔,培养.

1.2.6阳性杂交瘤细胞的筛选采用间接ELISA方法和HI试验进行阳性孔筛选,间接ELISA筛选时,用NDV-XX08作为包被抗原,同时用SPF鸡胚阴性尿囊液做对照,筛选出不与阴性尿囊液交叉反应的阳性孔.

1.2.7杂交瘤细胞的克隆采用有限稀释法对阳性孔的细胞进行克隆和亚克隆.

1.2.8单克隆抗体的诱生(1)体外诱生:阳性克隆化杂交瘤细胞转到24孔培养板或细胞培养瓶中,扩大培养,待细胞长满时停止换液,直至细胞全部死亡,收集培养上清,测定其ELISA效价; (2)体内诱生:选择经产BALB/c雌性小鼠,腹腔注入无菌液体石蜡,0.5 m L/只.10 d后,取阳性克隆化杂交瘤细胞,离心,GNK溶液洗涤,用无血清1 640培养基调整细胞数量,将细胞注入预处理的小鼠腹腔,5X106个细胞/只.待小鼠腹部明显膨大时,收集腹水,将腹水3000 r/min(4℃)离心30 min,收集中间清液,-20℃保存.

1.2.9单克隆抗体的鉴定(1)单克隆抗体效价的测定:用间接ELISA和HI检测杂交瘤细胞培养上清液和腹水抗体效价;(2)单克隆抗体的交叉反应性鉴定应用间接ELISA试验将阳性杂交瘤细胞培养上清分别与NDV、禽流感检测抗原(H5-4、H5-5、H5-6、H9)、传染性囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡胚阴性尿囊液、鸡正常组织液,鸡IgG进行交叉反应鉴定,测定抗NDV单克隆抗体的特异性.各样品的包被浓度与NDV相同;(3)Western-Blotting鉴定:将NDV样品进行SDS-PAGE电泳,对照组用考马斯亮蓝染液染色.试验组将蛋白转移到NC膜上,漂洗,封闭,加入酶联抗体温育,漂洗,加入生色底物进行特异性显带;(4)杂交瘤细胞稳定性测定:将杂交瘤细胞连续培养20代,反复冻存、复苏3次,检测其效价.

2　结果

2.1病毒的纯化NDV-XX08尿囊液血凝效价为211.尿囊液经差速离心纯化,病毒的血凝效价是216.经计算纯化NDV的蛋白含量为8.6 mg/mL.

2.2ELISA筛选方法的建立结果

2.2.1阳性血清最佳工作浓度包被抗原NDV的浓度固定,选择OD450nm值在1.0左右,P/N≥2.1比值最大的稀释浓度为最适工作浓度.通过表1确定小鼠血清最佳工作浓度为1∶2 000倍稀释.

表1　免疫小鼠抗血清的最适工作浓度

2.2.2检测抗原最佳工作浓度P/N≥2.1,OD值接近1.0的反应孔的最大稀释度作为抗原最佳工作浓度,通过表2确定抗原最佳工作浓度为1∶800.

表2　包被抗原最适工作浓度

2.3免疫小鼠血清抗体效价免疫BALB/c小鼠血液抗体效价为ELISA效价高于1∶1 600,HI效价高于1∶400,符合脾细胞融合要求.

2.4阳性杂交瘤细胞的建立经检测筛选分泌阳性抗体的杂交瘤细胞,并进行克隆、亚克隆.最终筛选出一株能分泌阳性抗体的杂交瘤细胞,其命名为4F12.

2.5单克隆抗体的效价检测结果

2.5.1ELISA效价杂交瘤细胞株4F12上清液和腹水间接ELISA效价分别为1∶160,1∶3.2X104.

2.5.2HI效价杂交瘤细胞株4F12上清和腹水血凝抑制效价分别检测,均没有血凝抑制活性.

2.6单克隆抗体特异性鉴定4F12细胞株分泌的单克隆抗体与NDV呈阳性反应,与阴性尿囊液,鸡正常组织液,鸡IgG、H5-4、H5-5、H5-6、H9、IBDV、IBV均呈阴性反应,结果见表3.

2.7SDS-PAGE电泳和Western-Blotting试验结果结果表明,McAb与NDV蛋白在分子质量为66 kDa和43 kDa之间呈特异性反应条带,说明获得的单克隆抗体是针对NDV某个抗原位点的.结果如图1所示.

表3　抗NDV单克隆抗体的交叉反应性结果

图1　纯化的NDV SDS-PAGE和McAb Western-Blotting结果

2.8杂交瘤细胞的稳定性4F12杂交瘤细胞株经连续20代培养,反复冻存、复苏3次,细胞生长良好,并且保持稳定的分泌抗体性.

3　讨论

由于免疫程序或免疫方法不合理,导致鸡群整体免疫水平不整齐,在免疫鸡群中越来越多的发生非典型新城疫,加上新城疫病毒不断发生变异,新基因型的出现,给新城疫的临床诊断带来很大的挑战.

本研究采用SDS-PAGE和Western-Blotting对NDV结构蛋白进行分析,结果发现,NDV经SDSPAGE电泳在66 kDa-43 kDa之间仅出现两条主要

条带,文献报道纯化的NDV进行SDS-PAGE可显示7条多肽[3].原因可能由于NDV的F蛋白,P蛋白,NP蛋白的分子量比较接近,电泳时不容易区分开,也可能样品处理过程中ND病毒结构遭到破坏.

Western-Blotting是利用抗体作探针来检测已转移到固相支持物上的靶蛋白.在本研究中,经Western-Blotting试验证明,制备的单抗能与NDV上其中一条多肽链发生特异性反应,此单克隆抗体究竟是针对NDV何种蛋白,还需要继续研究.本研究中获得的单克隆抗体无血凝抑制活性,其机理有待进一步研究.

[1]卢建红,张如宽,焦新安,等.快速检测鸡新城疫病毒的聚乙二醇单抗夹心ELISA试验的建立和应用[J].中国兽医科技, 1994,24(2):3-4.

[2]庄向生,林天龙,吴平,等.应用直接荧光抗体技术快速诊断鸡新城疫[J].中国兽医科技,1993,23(11):20-22.

[3]Chambers P,Millar N S,Bingham R W,et al.Molecular cloning of complementary DNA to Newcastle disease virus,and nucleo⁃tide sequence analysis ot the junction between the genes encoding the haemagglutinin-neuraminldase and the large protein[J].Gen Virol,1986,67(3):475-486.

Preparation and identification of themonoclonal antibody against Newcastle disease virus(NDV-XX08)

YIN Mei1,KONG Ling-yun1,Zhang Qiu-yu1,FENG Lan-zhu3,ZHOU Jie1,YUE Feng2,WANG Xuan-nian2
(1.College of Veterinary and Animal Sciences,Henan Istitute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China; 2.College of Life Sciense and Technology,Xinxiang University,Xinxiang 453003,China; 3.Xinxiang Hongqi District Animal disease prevention and control center,Xinxiang 453003,China)

In this study,the Newcastle Disease viruses were replicated to high titer in embryonated eggs and purified by differ⁃ential centrifugation.Then,Balb/C mice were immunized with the purified NDV particles.The spleen cells of immunized Balb/C mice were fused with NS0 murine myeloma cells after the titer of antiserum was analyzed.After being screened by indirect ELISA and HI assay,and then cloned by limiting dilution,a hybridoma named 4F12,which produces monoclonal antibody specifically against NDV,was successfully obtained.The McAb was characterized by ELISA,HI and western-blotting.The McAb ELISA titers from cell culture supernatant and ascites were 1∶160 and 1∶3.2X104,respectively.There were no cross-reactivity on negative allan⁃toic fluid and other avian virus antigens including AIV,IBV and IBDV.The HI assay had proved that the McAb were no HI activi⁃ty.And western-blotting analysis showed that the McAb specifically bound NDV.The hybridoma cell can stably secrete McAb against NDV after serial passages 20 times and freezing-revival three times in four months.In conclusion,a hybridoma which can secrete specific monoclonal antibody(McAb)against Newcastle Disease viruses(NDV)was obtained by hybridoma technique.The prepared McAb was specific.

Chicken;Newcastle Disease Virus;monoclonal antibody;Western-blotting

WANG Xuan-nian

S852.65+9.5

A

0529-6005(2016)02-000303

2014-10-27

国家自然科学基金项目(31272539)

银梅(1973-),女,副教授,硕士,从事兽医病理学教学和科研工作,E-mail:yinmeibao@qq.com

王选年,E-mail:xuannianwang@163.com