精骨补肾颗粒对地塞米松诱导骨质疏松症大鼠的保护作用

邢亚群， 王迪生*， 王 群， 魏 令， 耿春辉， 祝子明， 徐玉禄（.蚌埠医学院第二附属医院，安徽 蚌埠040；.蚌埠市第三医院骨科，安徽蚌埠000；.宣城市人民医院，安徽宣城4000）



精骨补肾颗粒对地塞米松诱导骨质疏松症大鼠的保护作用

邢亚群1， 王迪生1*， 王 群1， 魏 令2， 耿春辉1， 祝子明3， 徐玉禄1
（1.蚌埠医学院第二附属医院，安徽 蚌埠233040；2.蚌埠市第三医院骨科，安徽蚌埠233000；3.宣城市人民医院，安徽宣城242000）

目的 观察精骨补肾颗粒（黄精、骨碎补、桑葚等）对糖皮质激素性骨质疏松症（g1ucocorticoid induced osteoporosis，GIOP）大鼠的骨密度（BMD）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、碱性磷酸酶 （ALP）、肌钙蛋白 （Tn）、血清降钙素 （CT）、雌二醇 （E2）的影响及可能的作用机制。方法 将72只雌性大鼠随机分为正常对照组，模型对照组，阳性对照组 （仙灵骨葆胶囊），精骨补肾颗粒低、中、高剂量组。除正常对照组外，其余各组大鼠每周2次肌肉注射地塞米松2.5 mg/kg，同时每日灌胃给药连续9周。实验结束后眼球取血，用酶联免疫法测定大鼠Tn、TRAP、ALP、CT、E2指标，用双能X线骨密度仪对大鼠离体股骨上1/3 BMD进行检测。结果 GIOP大鼠对照组的TRAP、ALP明显升高，BMD、Tn、CT、E2明显降低，与正常对照组比较，有显著性差异 （P＜0.01）；精骨补肾颗粒低、中、高剂量组可显著降低GIOP大鼠TRAP、ALP含有量，显著升高BMD、Tn、CT、E2值，且存在一定的剂量依赖关系，与模型对照组比较有显著性差异 （P＜0.05或P＜0.01）。结论 精骨补肾颗粒对骨质疏松症大鼠具有一定的治疗作用。

精骨补肾颗粒；糖皮质激素性骨质疏松（g1ucocorticoid induced osteoporosis，GIOP）；骨密度（BMD）；抗酒石酸酸性磷酸酶 （TRAP）；碱性磷酸酶 （ALP）；肌钙蛋白 （Tn）；降钙素 （CT）；雌二醇 （E2）

骨质疏松（osteoporosis，OP）是常见的一种全身性骨代谢疾病，其显著特征是骨量减少、骨的微观结构退化、骨的脆性增加以及易于发生骨折［1］。糖皮质激素所致的骨质疏松称为糖皮质激素性骨质疏松（g1ucocorticoid induced osteoporosis，GIOP）。在继发性骨质疏松症中，GIOP其发病率仅次于绝经后和老年性骨质疏松症而居第3位，因此越来越受到重视。本研究以糖皮质激素 （GC）致大鼠骨质疏松模型为研究对象，以BMD、Tn、TRAP、ALP、CT、E2为主要指标，考察精骨补肾颗粒对GIOP模型大鼠的保护作用，探讨其作用机制。

1　实验材料

1.1实验药物 受试药物：精骨补肾颗粒 （Jinggu Bushen Granu1es），由黄精 15 g（批号1503028）、骨碎补 10 g（批号1502018）、桑葚15 g（批号1503119）、附子10 g（批号1502118）、淫羊藿15 g（批号1504047）、黄芪10 g（批号1502050）、川芎5 g（批号1503125）、地鳖虫5 g（批号1504031）、决明子10 g（批号1502059）、茯苓10 g（批号1503152）组成，采用江阴天江药业有限公司提供的单位浓缩颗粒均匀混合而成。阳性对照药：仙灵骨葆胶囊，由贵州同济堂制药有限公司生产，批号140911。上述药物临用时，用蒸馏水配成适当剂量使用。

1.2实验试剂 地塞米松磷酸钠注射液 （天津药业集团新郑股份有限公司，批号1101264）；酸性磷酸酶 （批号 20141107）、碱性磷酸酶 （批号20141026）、肌钙蛋白 （批号20141025）、降钙素（批号20141106）、雌二醇酶联免疫试剂盒 （批号20141228），均购于上海源叶生物科技有限公司。

1.3实验仪器 XR-2626型双能X线骨密度仪（美国，NORLAND）；MK3全自动酶标分析仪（上海弘联公司）；-80℃超低温冰箱 （美国Advantage）；LDZ4型微量离心机 （北京医用离心机厂）；电子天平（美国METTLER TOLEDO）；微量移液器（德国Eppendorf）。

1.4实验动物 16周龄SPF级Wistar大鼠72只，雌性 （雌性未孕），购于南京医科大学动物中心，合格证号：SCXK（苏）2008-0004。低钙饲料及全价饲料均购于安徽长临河医药科技有限公司，合格证号SCXK（皖）2007-001。

2　实验方法

2.1动物分组 取Wistar大鼠72只，雌性（未孕），体质量200～250 g，实验室适应性饲养7 d后，随机均分为6组，每组12只，即正常对照组，模型对照组，阳性对照组 （仙灵骨葆胶囊，0.27 g/kg），精骨补肾颗粒低、中、高 （2.93、5.86、11.72 g/kg）剂量组。

2.2造模方法 除正常对照组外，其余各组大鼠于左后肢臀部肌肉注射地塞米松2.5 mg/kg体质量，每周2次，并给予低钙饲料 （配方：玉米面45%，白面30%，豆饼15%，麸子7.5%，鸡蛋1%，豆油1%及酵母0.5%）喂养，连续9周。正常对照组大鼠给予全价饲料 （配方：玉米面40%，豆饼10%，白面26%，麸子10%，鱼粉10%，骨粉2%，复合维生素1%及盐1%）喂养。

2.3给药方法 各组大鼠适应饲养1周后按“2.2”项方法造模，同时阳性对照组和药物组按照剂量1 mL/100 g体质量灌胃给予相应药物，每天1次，连续9周；正常对照组和模型对照组大鼠灌胃等容量蒸馏水。

2.4指标检测方法 末次给药后，各组大鼠禁食（不禁水）24 h，用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g体质量腹腔注射麻醉，进行以下指标检测。

2.4.1骨密度测定 组织取材：先用生理盐水冲洗大鼠全股骨，将医用纱布用生理盐水浸渍后，对全股骨进行包裹，再用预先准备的锡纸包裹。大鼠离体股骨上1/3骨密度应用双能X线骨密度仪进行检测。实验数据应用“The Sma11 Subject Scoutcan”小动物软件进行分析。

测定方法：参数设置，扫描速度为60mm/s，扫描宽度为10cm，长度可任意调节，分辨率为1.0mm×1.0mm，组内CV（变异系数）在0.82%～1.24%之间。实验结果骨密度采用单位面积内的骨矿物质含有量表示（g/cm2）。

2.4.2肌钙蛋白测定 取出大鼠右后肢腓肠肌的白肌部分，用人黑色素细胞刺激素 （MSH）缓冲液清洗、擦干、称重后，用剪刀剪碎放入匀浆瓶中，将0.2g/mL组织加入匀浆液中，并加入蛋白酶抑制剂5μL/mg，以500r/min匀浆充分，将匀浆后的组织以2000r/min，离心10min，除去脂肪层和上清，再以5000r/min，离心15min，除上清，提取线粒体放入1mLEP管中。具体检测步骤按试剂盒说明书进行。

2.4.3血清磷酸酶、降钙素、雌二醇测定 腹主动脉取血8mL，静置，3000r/min离心10min，取血清进行上述指标检测。具体检测步骤按试剂盒说明书进行。

2.5数据统计方法 试验数据以SPSS13.0for windows软件包处理，结果以均数±标准差 （± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有高度显著性差异。

3　实验结果

3.1精骨补肾颗粒对GIOP大鼠BMD和Tn的影响 实验结果显示：GIOP模型对照组大鼠BMD明显降低，Tn含有量明显减少，与正常对照组比较，有显著性差异 （P＜0.01）；精骨补肾颗粒低、中、高剂量组可显著增加GIOP大鼠BMD值，提高Tn含有量，且存在一定的剂量依赖关系，与模型对照组比较有显著性差异 （P＜0.05或P＜0.01）。详见表1。

表1　精骨补肾颗粒对GIOP大鼠BMD和Tn的影响（±s）Tab.1 EffectsofJingguBushenGranulesonthecontentofBMDinserumofosteoporosisrats（±s）

表1　精骨补肾颗粒对GIOP大鼠BMD和Tn的影响（±s）Tab.1 EffectsofJingguBushenGranulesonthecontentofBMDinserumofosteoporosisrats（±s）

注：与正常对照组比较，#P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别　　剂量/（g·kg-1）　　动物数/只　BMD/［g·（cm2）-1］　Tn/（mg·L-1）正常对照组-12　0.170±0.015　35.7612±2.6613模型对照组　-　12　0.136±0.014#　13.8181±1.2591#阳性对照组　0.27　12　0.149±0.011*　23.5758±2.0461**精骨补肾颗粒低量组　2.93　12　0.147±0.007*　22.1958±1.9512**精骨补肾颗粒中量组　5.86　12　0.154±0.008**　24.1860±1.5703**精骨补肾颗粒高量组　11.72　12　0.159±0.008**　25.5066±1.2143 **

3.2精骨补肾颗粒对GIOP大鼠TRAP、ALP、CT、E2的影响 实验结果显示：GIOP模型对照组大鼠TRAP、ALP明显升高，CT、E2明显降低，与正常对照组比较，有显著性差异 （P＜0.01）；精骨补肾颗粒低、中、高剂量组可显著降低GIOP大鼠TRAP、ALP含有量，增加CT、E2含有量，且存在一定的剂量依赖关系，与模型对照组比较有显著性差异 （P＜0.05或P＜0.01）。详见表2。

表2　精骨补肾颗粒对骨质疏松模型大鼠血清TRAP、ALP、CT、E2的影响（±s，n=12）Tab.2 EffectsofJingguBushenGranulesonthecontentofTRAP，ALP，CT，E2inserumofosteoporosisrats（±s，n=12）

表2　精骨补肾颗粒对骨质疏松模型大鼠血清TRAP、ALP、CT、E2的影响（±s，n=12）Tab.2 EffectsofJingguBushenGranulesonthecontentofTRAP，ALP，CT，E2inserumofosteoporosisrats（±s，n=12）

注：与正常对照组比较，#P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别　　剂量/（g·kg-1）　TRAP/（U·L-1）　ALP/（U·L-1）　CT/（μg·mL-1）　E2/（pg·mL-1）正常对照组-13.82±1.33　61.65±2.48　55.37±3.63　141.971±7.641模型对照组　-　18.52±1.34#　87.17±4.11#　44.87±2.14#　100.126±4.86#阳性对照组　0.27　14.68±1.55**　71.93±3.94**　50.14±3.14**　127.392±5.951**精骨补肾颗粒低量组　2.93　17.36±1.24*　74.31±6.35**　49.74±1.96**　130.750±3.266**精骨补肾颗粒中量组　5.86　15.98±1.51**　72.83±5.39**　51.79±2.29**　133.702±1.696**精骨补肾颗粒高量组　11.72　14.90±1.23**　72.52±6.86**　52.77±2.52**　135.959±2.877**

4　讨论

现代医学认为骨质疏松症是一种以全身骨量减少 （即骨基质和骨矿物质等比例减少）为主要特征的全身性骨代谢疾病，分为原发性、继发性和特发性3类。在继发性骨质疏松中，糖皮质激素（GC）在临床的广泛使用是其主要诱因，因其促进肾脏对钙的排除、抑制小肠对钙的吸收等作用，故长期使用易引起低血钙症，导致骨质疏松。应用外源性GC后一年的病人，GIOP的发生率可达0.6%～6%［2］。因此，尽管采用去势法切除双侧卵巢可成功复制大鼠骨质疏松证模型［3-4］，但本实验采糖皮质激素配合低钙饲料复制的GIOP大鼠模型更符合临床实际。

中国传统医学认为骨质疏松症属于骨枯、骨痿、骨蚀、骨痹、骨极等范畴，在历代中医文献均有记载。《素问·痿论》云：“肾主身之骨髓……肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”。《景岳全书·痿论》云：“肾者，水脏也，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不能任身，发为骨痿”。因此，中医学认为肾虚是骨质疏松症的根本病机，因肾精乏源、骨骼失养、骨骼脆弱无力可致骨质疏松症。从中医理论认识GC，它应属于 “纯阳”之品，长久使用，势必耗损阴精与气血，中医阴精是与机体有关的活性物质，构成骨质的活性物质属于阴精范畴，因此，“纯阳”之品过量必将导致骨质疏松证。此外，“久病及肾”，肾中精气亏虚，阴阳失衡进一步加重肾虚，“主骨生髓”失职，骨髓生化无源，诱发骨质疏松症是必然的。对此，中医治疗该证多从补肾调肾论治［5-7］。因此，中医对GIOP大鼠模型的认识与现代医学的研究是一致的，GIOP大鼠模型与中医肾虚性骨质疏松模型比较接近，可以作为研究治疗补肾治疗骨质疏松症的实验模型［8-9］。

骨密度全称是骨骼矿物质密度，是骨骼强度及骨质量的一个重要指标，可以反映骨质疏松程度，是预测骨折危险性的重要依据［10］对早期诊断、预防骨质疏松及评估干预措施效果等方面有重要意义。肌钙蛋白存在于骨骼肌和心肌中，调节肌肉的收缩和舒张状态，肌钙蛋白C亚型可与Ca2+结合活化ATP酶，从而引起肌肉肌球蛋白收缩，调节收缩过程；肌钙蛋白T亚型将肌钙蛋白复合体连接到原肌球蛋白和肌动蛋白分子上，调控肌原纤维的收缩；肌钙蛋I亚型抑制肌动蛋白-肌凝蛋白互动的ATP酶活性，从而抑制肌球蛋白与肌动蛋白结合，阻止肌肉收缩［11］。因此肌钙蛋白在临床中多用为骨骼肌损伤和骨质疏松的特异性标志物。本实验结果显示，精骨补肾颗粒可以显著增加GIOP大鼠BMD值，提高肌钙蛋白含有量，提高肌肉组织能力代谢有效保护骨组织［12］。

现代医学对于骨质疏松的治疗原则［13］，主要为抑制骨吸收，促进骨形成。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）是由破骨细胞分泌，是破骨细胞功能的标志，骨吸收时，TRAP参与骨基质中固体钙磷矿化物的降解。而碱性磷酸酶 （ALP）则是由成骨细胞生成，ALP含有量的变化可以预示骨细胞增殖的程度，是骨重建活跃性和成骨细胞活动性增加的特异性指征［14］。降钙素 （CT）是一种破骨细胞的抑制剂，CT可通过受体CTR介导作用于破骨细胞，减少其活性和数量，对调节成骨细胞的活性、促进骨生成具有重要意义［15］。雌激素 （E2）在维持骨量平衡、稳定中具有重要作用。研究表明骨组织形成和溶解都受到雌激素的调节，成骨细胞与破骨细胞上都存在雌激素受体。当雌激素与成骨细胞上的受体相结合，可介导成骨细胞胶原蛋白合成、钙盐的沉积和类骨质的形成，从而形成骨组织［16］；而当雌激素与破骨细胞上的受体相结合时，则可抑制破骨细胞的溶骨功能。

精骨补肾颗粒在医院多年使用的验方的基础上加味所得，以温补肝肾精阴的黄精、骨碎补、桑葚等为主药，填精补髓，治病求本；采取 “阳中求阴”治法，选用附子、淫羊藿补肾阳，阴阳双补，相得益彰，本实验结果显示，精骨补肾颗粒能提高大鼠骨密度、肌钙蛋白含有量，降低碱性磷酸酶和酸性磷酸酶含有量，提高血清降钙素水平及恢复雌激素的平衡，对骨质疏松模型大鼠具有一定的治疗作用，为中医 “肾主骨”中医理论防治骨质疏松提供了实验依据。

［1］肖建德.实用骨质疏松学［M］.北京：科学出版社，2004：31.

［2］刘 媛，王永福，刘忠厚.糖皮质激素和骨质疏松关系的研究进展［J］.中国骨质疏松杂志，2010，16（9）：713-718.

［3］郑洪新，燕 燕，王思程，等.“肾藏精生髓主骨”藏象理论研究— “肾虚骨质疏松症大鼠转化生长因子相关基因及蛋白表达的异常［J］.世界科学技术：中医药现代化，2010，12（1）：57-64.

［4］黄 彤，金邦荃，孙桂菊，等.葛根素对去卵巢大鼠骨密度和骨强度的改善［J］.现代预防医学，2010，37（20）：3894-3896.

［5］朱 辉，郑洪新.骨质疏松症 “从肾论治”古今研究［J］.中华中医药学刊，2011，29（8）：1741-1742.

［6］王小敏，赵丽坤，刘新霞，等.枸杞多糖对糖皮质激素性骨质疏松大鼠钙吸收及生化指标的影响［J］.中国预防医学杂志，2011，12（12）：1004-1007.

［7］胡志俊，王世伟，刘文波，等.骨质疏松的中医辨证分型研究［J］.中国中医骨伤科杂志，2012，20（1）：23-25.

［8］苏俊声.从肾防治糖皮质激素性骨质疏松症的理论与临床研究［D］.广州：广州中医药大学，2013.

［9］王 剑，郑洪新，刘瑞辉，等.补肾中药复方对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠骨和肾组织D1x5 mRNA及蛋白表达的影响［J］.中华中医药杂志，2012，27（4）：951-953.

［10］何渝煦，魏庆中，熊启良，等.骨质疏松性骨折与骨密度关系的研究进展［J］.中国骨质疏松杂志，2014，20（2）：219-224.

［11］王洪恩，张慧敏.运动性骨骼肌和心肌损伤与肌钙蛋白的关系［J］.中国临床康复，2005，32（9）：201-203.

［12］杨 芳，郑洪新，朱 辉，等.补肾、健脾、活血法对糖皮质激素诱导骨质疏松症大鼠骨密度、骨骼肌肌钙蛋白影响的比较研究［J］.辽宁中医杂志，2011，38（5）：871-873.

［13］邓阿黎，周忠明，姜惠中，等.滋补肝肾中药方对去卵巢骨质疏松模型大鼠骨组织影响的实验研究［J］.中国药师，2011，14（2）：154-157.

［14］涂国卿，邹来勇.热敏灸对骨质疏松大鼠ALP表达的影响［J］.时珍国医国药，2011，22（9）：2134-2135.

［15］李 环，韩丽萍，梁 芳.仙鹿壮骨方对去卵巢大鼠骨质疏松症骨密度和血清降钙素的影响［J］.甘肃中医学院学报，2010，27（6）：4-6.

［16］黄海玲，李 海，王金花，等.雌激素与不同剂量的葛根素联合对去卵巢大鼠骨质疏松的影响［J］.中国妇幼保健，2011，26（33）：5228-5231.

Protective effects of Jinggu Bushen Granules on dexamethasone-induced osteoporosis rats

XING Ya-qun1， WANGDi-sheng1*， WANGQun1， WEILing2， GENGChun-hui1， ZHU Zi-ming3，XU Yu-1u1

（1.The Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233040，China；2.The Third People's Hospital of Bengbu，Bengbu 233000，China；3.The People's Hospital of Xuancheng City，Xuancheng 242000，China）

AIM To study the effects of Jinggu Bushen Granu1es（Polygonati Rhizoma，Drynariae Rhizoma，Mori Fructu，etc.）on g1ucocorticoid induced osteoporosis（GIOP）in rat bone minera1 density（BMD），tartrate resistant acid phosphatase（TRAP），a1ka1ine phosphatase（ALP），troponin（Tn），ca1citonin（CT），estradio1（E2），and to exp1ore themechanism of it preventing and treating osteoporosis to serve an experimenta1basis for c1inica1app1ications.METHODS Seventy-two Wistar-Kyoto strain rats were random1y divided into six groups：norma1group，contro1group，positive group with Xian1ing Gubao Capsu1es，experimenta1groupswith Jinggu Bushen Granu1es 1ow-，medium-and high-dose.Except for the norma1group，a11of the groupswere injected with dexamethasone for two weeks and fed respective1y with correspondingmedicines for nine weeks.After the 1ast administration，rats'eyeba11s were picked up to obtain b1ood.The assay of Tn，TRAP，ALP，CT and E2in serum were measured by ELISA；in vitro the BMD proxima1one third of the femurwas determined by dua1-energy X-ray absorp-tiometry.RESULTS In GIOPmode1group，the contents of TRAP，ALP increased and BMD，Tn，CT，E2reduced with significant differences compared to those of the norma1 group（P＜0.01）.In three experimenta1 groups，the contents of TRAP，ALP reduced and the BMD，Tn，CT，E2increased.There were significant differences compared to the mode1group（P＜0.05 or P＜0.01）.CONCLUSIONS The experimenta1 resu1ts have suggested that Jinggu Bushen Granu1es have certain protective effects against GIOP rats.

Jinggu Bushen Granu1es；GIOP（g1ucocorticoid induced osteoporosis）；BMD（bone minera1 density）；TRAP（tartrate resistant acid phosphatase）；ALP（a1ka1ine phosphatase）；Tn（troponin）；CT（ca1citonin）；E2（estradio1）

R285.5

A

1001-1528（2016）06-1221-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.004

2016-01-30

安徽省卫生厅中医药管理局科研计划 （2014XY39）

邢亚群 （1975—），女，硕士，副主任药师，研究方向为药物代谢动力学。Te1：（0552）3111625，E-mai1：17072530@ qq.com

王迪生 （1956—），男，硕士，主任药师，副教授，硕士生导师，研究方向为中药新药研究与开发。Te1：（0552）3111625，E-mai1：Wangdisheng2168@a1iyun.com