融合菌株转化黄芪药渣生产乙醇的工艺

张 英， 郑清炼， 周裕权， 周 林（.广州中医药大学中药学院，广东广州50006；2.广东药科大学，广东广州50006）



融合菌株转化黄芪药渣生产乙醇的工艺

张 英1， 郑清炼1， 周裕权1， 周 林2*
（1.广州中医药大学中药学院，广东广州510006；2.广东药科大学，广东广州510006）

目的 研究融合菌株转化黄芪药渣生产乙醇的工艺。方法 以黄芪药渣为原料，运用筛选出的融合子D2菌株，研究分步糖化发酵、同步糖化共发酵、改进同步糖化共发酵、两步同步糖化共发酵4种工艺路线下乙醇的生产情况，并与高产乙醇的酿酒酵母比较。结果 两步同步糖化共发酵乙醇体积分数最高，为20.4 g/L，其次为分步糖化发酵、改进同步糖化共发酵、同步糖化共发酵。在相同工艺路线下，融合菌株生产乙醇的能力较酿酒酵母要强。结论

该工艺可促使乙醇产量得到较大幅度的提高。

黄芪；药渣；乙醇；融合菌株

中药药渣来源于中成药生产、中药材加工与炮制、原料药生产等，并以中成药生产带来的药渣量最大，约占总量的70%。随着我国中医药事业的迅速发展，全国各大中药制药厂的中药渣废弃量日益增加，年排放量达60万吨以上［1］。目前，中药渣利用率低，除少数生态化利用外，大多作为市政垃圾而被大量焚烧或填埋。

近年来国外研究表明，纤维质原料生产生物燃料具有广阔的应用前景［2-7］。中药药渣作为廉价的木质纤维素原料，其主要成分为纤维素，其次为半纤维素。以往对纤维质原料资源化的研究大多集中于纤维素的利用，而忽略了半纤维素的生物转化，致使乙醇产率不够理想。课题组通过前期研究，将树干毕赤酵母 （能利用木糖）与酿酒酵母（能利用葡萄糖）进行原生质体融合，得到既能利用葡萄糖，又能利用木糖的融合子。中药药渣首先经过纤维素酶和木聚糖酶处理，其中的纤维素和半纤维素分别被降解为葡萄糖和木糖，两者均能被融合菌株利用而产生乙醇，有望在原有乙醇产量的基础上进一步提高其得率。

本研究首先采用筛选出的生产乙醇能力最强的融合子D2，研究4种工艺路线 （分步糖化发酵、同步糖化共发酵、改进同步糖化共发酵、两步同步糖化共发酵）下乙醇的产量。然后，在相同工艺路线下，比较高产乙醇的酿酒酵母与D2菌的生产能力，以确定融合菌株是否优于基础菌株。

1　仪器和试剂

LDZX-50FBS立式蒸气灭菌锅 （上海申安医疗器械厂）；DHZ-CA振荡器（太仓市实验设备厂）；CR-22G离心机 （日本日立公司）。

黄芪药渣（自制）；D2菌 （本实验室通过原生质体融合得到）；安琪酿酒高活性干酵母 （安琪酵母股份有限公司）；酵母膏 （广州环凯生物科技有限公司）；蛋白胨 （广州环凯生物科技有限公司）；葡萄糖 （天津市福辰化学试剂厂）；琼脂 （广州环凯生物科技有限公司）；复合纤维素酶（广州翔博生物科技有限公司）；多效木聚糖酶 （广州翔博生物科技有限公司）。（NH4）2HPO4、MgSO4·7H20、NaOH、H2SO4、乙醇均为分析纯。

2　实验方法

2.1种子的制备

2.1.1菌种的活化 活化培养基为1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂。将D2菌从保藏培养基接种一环至活化培养基的平板，30℃下培养24 h。

2.1.2种子的制备 种子培养基为1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖。从活化培养基的平板上接种一环D2菌至15mL种子培养基 （发酵实验每个样品接种5 mL，重复3份），30℃、150 r/min下培养24 h。

2.2药渣的预处理 称取已平衡水分的黄芪药渣10 g，倒入250mL烧瓶中，加入150mL 1.0%稀硫酸，于120℃下保温2 h，处理后的样品转入250 mL血清瓶中。

2.3发酵培养基的制备 上述样品加入酵母膏 （0.3%）、（NH4）2HPO4（0.025%）、MgSO4·7H20（0.025%），配制好的培养基用NaOH溶液调节pH 4.8，121℃下灭菌20 min。

2.4融合菌株转化黄芪药渣的工艺研究

2.4.1分步糖化发酵工艺 在 “2.3”项下发酵培养基中加入20 g复合纤维素酶、10 g多效木聚糖酶，50℃、250 r/min酶解96 h。酶解产物于16 000 r/min转速下离心20 min，上清液转入250mL血清瓶中，115℃下灭菌20 min。冷却后，接入5mL种子，30℃、150 r/min下发酵96 h。

2.4.2同步糖化共发酵工艺 在 “2.3”项下发酵培养基中加入20 g复合纤维素酶、10 g多效木聚糖酶、5 mL种子，30℃、150 r/min下发酵96 h。

2.4.3改进同步糖化共发酵工艺 在”2.3”项下发酵培养基中加入20 g复合纤维素酶、10 g多效木聚糖酶，50℃、250 r/min下酶解8 h。再接入5 mL种子，30℃、150 r/min下发酵96 h。

2.4.4两步同步糖化共发酵工艺 在 “2.3”项下发酵培养基中加入10 g多效木聚糖酶，50℃、250 r/min下酶解8 h。再接入5 mL种子，加入5 g复合纤维素酶，30℃、150 r/min下发酵48 h。再加入剩下的15 g纤维素酶，继续发酵48 h。

2.4.5具体工艺路线 见图1。

2.5融合菌株D2与安琪酿酒高活性干酵母产酒精能力的比较 采用同步糖化共发酵工艺，融合菌株组接入的种子为5 mL液态种子，酵母组接入0.5 g活性干酵母粉。

2.6样品中乙醇含有量的测定 参考文献 ［8］。

3　实验结果与分析

3.1不同工艺路线融合菌株转化黄芪药渣产乙醇的情况

各工艺路线下样品的气相色谱图见图2（传统与改进同步糖化共发酵的分离效果不理想，故图谱略去），乙醇含有量见表1。

从表可知，两步同步糖化共发酵工艺优于传统和改进同步糖化共发酵，其原因一方面，可能是前者在前8 h内只加入木聚糖酶，发酵液中刚开始只有木糖而没有葡萄糖，当菌种加入后则首先利用木糖，对乙醇产量的提高起着至关重要的作用［9-10］；另一方面，8 h后在发酵液中只加入25%纤维素酶，使得发酵液在接下来48 h内葡萄糖产量不是太高，融合子能够继续利用发酵液中的木糖。文献 ［11-12］报道，当发酵培养基中既有葡萄糖又有木糖存在的情况下，菌体首先会利用葡萄糖，两步同步糖化共发酵工艺克服了这一弊端，木糖的高效利用可导致乙醇产量的提高。另外，分步糖化发酵工艺得到的乙醇含有量也高于两者，可能是由于药渣酶解时间较长，葡萄糖和木糖产量较高，使得发酵液中生物量较大，并最终得到较高产量的乙醇。

图1　各工艺路线图

表1　乙醇含有量（±s，n=3）

工艺路线　　乙醇/（g·L-1）20.4±1.5 17.3±0.9同步糖化共发酵　14.5±1.4改进同步糖化共发酵　16.3±1.2两步同步糖化共发酵分步糖化发酵

3.2融合菌株D2与安琪酿酒高活性干酵母产酒精能力的比较 融合菌株和酿酒酵母均采用同步糖化共发酵工艺进行发酵，而且其参数为酿酒酵母发酵产乙醇最优的条件，气相色谱图见图3。结果，在相同工艺路线下，D2菌产乙醇的能力较酿酒酵母强，前者乙醇含有量为14.5 g/L，后者为12.6 g/L。由此表明，该融合子具备双亲的特征，既能利用葡萄糖，又能利用木糖，融合菌株在酿酒酵母的基础上得到改良。

图2　各工艺路线气相色谱图

4　结论与讨论

国内外对纤维质原料转化为生物燃料进行了几十年的研究，从最初的只能利用葡萄糖分步和同步糖化发酵，到后来的分步和同步糖化共发酵，工艺路线得到不断改进，而本实验对同步糖化共发酵工艺进一步完善，采用两步同步糖化共发酵。首先，前酶解时只加入木聚糖酶，让发酵液中先产生木糖，保证半纤维素的高效利用。之后加入25%纤维素酶，使葡萄糖保持一个比较低的含有量。最后加入剩下的纤维素酶。此工艺较传统和改进同步糖化共发酵下乙醇的产量都要高，达到20.4 g/L。同步糖化共发酵是在酶解时，葡萄糖和木糖的发酵均在一个容器内进行，与分步糖化发酵相比有诸多优点，如降低成本、减少过程时间、减少污染风险等。此工艺成为现今研究的热点，而同步糖化共发酵工艺还有进一步完善的空间，同时其过程机制还需要作进一步探讨。

本实验同时比较了高活性酿酒酵母和融合子D2菌产酒精能力，发现在同样的工艺路线下，后者乙醇产量高，表明树干毕赤酵母和酿酒酵母经原生质体融合后，菌种得到了改良。

只有优良的菌种和优化的工艺才能带来理想的结果，故后续将通过对过程进行动力学研究，以期得到更加优化的工艺参数，并最终得到更高产量的乙醇。

图3　不同菌株发酵样品气相色谱图

［1］周达彪，唐懋华.中药渣农业循环利用模式产业化探讨［J］.上海蔬菜，2007（6）：112-114.

［2］Frederick W J，Lien SJ，Courchene CE，et al.Co-production of ethano1 and ce11u1ose fiber from southern pine：a technica1 and economic assessment［J］.Biomass Bioenerg，2008，32（12）：1293-1302.

［3］Jin M J，Gunawan C，Ba1an V，et al.Simu1taneous saccharification and co-fermentation（SSCF）of AFEX（TM）pretreated corn stover for ethano1production using commercia1enzymes and Saccharomyces cerevisiae 424A（LNH-ST）［J］.Bioresour Technol，2012，110：587-594.

［4］Jeihanipour A，Karimi K，Nik1asson C，etal.A nove1process for ethano1or biogas production from ce11u1ose in b1ended-fibers waste texti1es［J］.Waste Manag，2010，30（12）：2504-2509.

［5］江 丹，李旭晖，朱明军.造纸污泥同步糖化发酵产乙醇的研究［J］.食品与发酵工业，2009，35（11）：32-35.

［6］Zhu Z S，Li X H，Zheng QM，etal.Bioconversion of amixture of paper s1udge and extraction 1iquor from water prehydro1ysis of euca1yptus chips to ethano1using separate hydro1ysis andfermentation［J］.Bioresources，2011，6（4）：5012-5026.

［7］Park I，Kim IKang K，et al.Ce11u1ose ethano1production from waste newsprint by simu1taneous saccharification and fermentation using Saccharomyces cerevisiae KNU5377［J］.Process Biochem，2010，45（4）：487-492.

［8］张 英，吴献跃，李 馨，等.中药药渣同步糖化发酵生产乙醇的工艺研究［J］.中成药，2013，35（9）：2053-2056.

［9］Kuyper M，Hartog M M，Toirkens M J，et al.Metabo1ic engineering ofa xy1ose-isomerase-expressing Saccharomyces cerevisiae strain for rapid anaerobic xy1ose fermentation［J］.FEMS Yeast Res，2005，5（4-5）：399-409.

［10］O1ofsson K，Rudo1f A，Liden G.Designing simu1taneous saccharification and fermentation for improved xy1ose conversion by a recombinantstrain of Saccharomyces cerevisiae［J］.JBiotechnol，2008，134（1-2）：112-120.

［11］Jin M J，Lau M W，Ba1an V，et aL.Two-step SSCF to convert AFEX-treated switchgrass to ethano1using commercia1 enzymes and Saccharomyces cerevisiae424A（LNH-ST）［J］.Bioresour Technol，2010，101（21）：8171-8178.

［12］Jin M J，Sarks C，Gunawan C，etal.Phenotypic se1ection ofa wi1d Saccharomyces cerevisiae strain for simu1taneous saccharificationand co-fermentation of AFEX pretreated cornstover［J］. Biotechnol Biofuels，2013，6：108.

Q946

B

1001-1528（2016）06-1421-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.049

2015-09-06

国家自然科学基金资助项目 （81403193）；广州中医药大学 “青年英才培养工程”资助项目 （QNYC20140112）；广东省自然科学基金项目 （2014A030313587）

张 英（1976—），女，副教授，研究方向为工业三废的处理和资源化利用。E-mai1：tjxyzyzy@163.com

周 林（1977—），男，讲师，研究方向为生物活性物质及其利用。E-mai1：zhou1in@gdpu.edu.cn