猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用

邹　敏，李陆梅，宫　晓，王　红，杨旭兵，范根成（青岛易邦生物工程有限公司，动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛　266114）

猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用

邹敏，李陆梅，宫晓，王红，杨旭兵，范根成
（青岛易邦生物工程有限公司，动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛266114）

参考GenBank中发表的猪细小病毒（PPV）VP2基因序列，应用Primer5.0软件设计了一对引物，预期目的条带约591 bp。对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了试验，建立了PPV的PCR检测方法。符合性实验结果表明，该PCR方法优于HA、VI以及IHA。使用该方法对215份病料进行了检测，检出阳性样品25份，检出率为11.63%。结果表明，该方法可用于PPV的诊断及流行病学监测。

猪细小病毒；VP2基因；聚合酶链式反应；检测

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）是一类小DNA病毒，是引起猪繁殖障碍的主要病原之一，主要引起母猪，特别是初产母猪及血清学阴性经产母猪发生流产、不孕，产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等［1-3］。该病广泛分布于世界各地，并在大多数猪场呈地方性流行，严重影响养猪业的发展。PPV感染可依据临床症状和流行病学做出初步诊断，但进一步确诊需实验室诊断。自1967年Cartwright等首次报道PPV以来，有关诊断方法的研究报告较多。病毒分离鉴定、血凝及血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验等免疫学方法，核酸探针、聚合酶链式反应等分子生物学技术，均可应用于PPV的诊断［4-7］。

本研究在多株PPV VP2基因序列比对基础上，设计了一对特异性引物，建立了一种简单、快速、灵敏度高和特异强的检测方法，并对门诊收集的215份病料进行了应用性检测。结果表明，该方法可用于PPV感染及发病的检测、临床诊断和疫病监测。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株。PPV、CSFV、PCV2、PRRSV和PRV毒株均由青岛易邦生物工程有限公司动物基因工程疫苗国家重点实验室提供。

1.1.2 病料的采集与保存。215份病料，由青岛易邦生物工程有限技术服务部提供，主要来自山东、河北等8个省份的疑似发病猪场。病料主要包括脾、肺、扁桃体、淋巴结、死胎等，-20 ℃保存待检，长期保存则置-70 ℃冰箱。

1.1.3 主要试剂。DNAzol®，购自Invitrogen公司；rTaq DNA聚合酶、dNTPs、DL2 000 DNA Marker等，均购自宝生物（大连）工程有限公司；DNA胶回收试剂盒，购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病料的来源及处理。取病料每份1.0～2.0 g剪碎后，加少量灭菌PBS（含青、链霉素100 U/mL）于无菌研磨器中研磨至糊状，用PBS按1: 4的体积比稀释，-20～37 ℃反复冻融3次，经8 000 r/min 4 ℃离心10 min，收集上清液，-70 ℃保存备用。

1.2.2 引物。根据GenBank收录的PPV全基因序列为模板，以VP2为靶基因，设计一对引物，上游引物序列：5'-CAAATAGTTGTCCTGGT-3'；下游引物序列：5'-AAGGAGACCAACACCC-3'；预扩增片段长度为591 bp。

1.2.3 DNA的 提 取。 按Invitrogen公 司 的DNAzol®试剂盒使用说明书进行。

1.2.4 PCR扩增。按以下体系和参数进行：模板 DNA 3 µL、P1（25 pmol/µL）0.5 µL、P2 （25 pmol/µL）0.5 µL、rTaq（2U/µL）0.2 µL、10×rTaq×Buffer 2.5 µL、dNTP（2.5 mmol/µL）2 µL，其余用灭菌水补足至25 µL；95 ℃预变性5 min，94℃ 30 sec、50 ℃ 30 sec、72 ℃ 40 sec，共32个循环，72 ℃延伸10 min。反应完成，取PCR产物5 µL，用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳观察。

1.2.5 特异性试验。以PPV标准毒株、CSFV、PCV、PRRSV和PRV阳性毒株提取的基因组为模板，进行PCR扩增，同时设阴性对照。将PPV PCR扩增产物按照DNA胶回收试剂盒说明书进行回收纯化，然后送上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果与GenBank进行序列同源性比较。

1.2.6 敏感性试验。提取PPV标准毒株基因组，经紫外分光光度计测得DNA含量为100 mg/mL，然后按10倍梯度倍比稀释到10-9mg/mL。以此为模板进行PCR扩增。

1.2.7 重复性试验。将1.2.6节提取的PPV标准毒株DNA溶液分成三份，每份3 µL，由三人进行批内重复性PCR检测。再取3份PPV标准毒溶液各250 µL，按Invitrogen公司的DNAzol®试剂盒使用说明书进行DNA提取，然后进行批间重复性PCR检测。

1.2.8 符合性试验。随机抽取1.1.2节收集的临床发病猪的20份病料，分别进行PPV PCR检测、HA检测、病毒培养和间接免疫荧光法检测，以验证本法与其他PPV检测方法的符合性。

1.2.9 样品检测。用所建立的PCR方法，从215份样品中提取DNA，进行检测。

2　结果

2.1 特异性PCR产物鉴定结果

扩增产物经电泳观察，只有PPV的PCR产物在591 bp附近有一条与预计大小相符的条带，而CSFV、PCV、PRRSV、PRV和阴性对照都没有条带，见图1。

图1　特异性试验结果

将扩增产物回收纯化、测序，测序结果登陆GenBank进行序列比较，结果表明所得到的片段与GenBank收录的PPV相应片段的同源性都在97%以上。具体序列见图2。

图2　PCR产物测序结果

2.2 敏感性试验结果

扩增产物经电泳观察，发现PPV标准毒株DNA稀释度在10-1～10-8范围内的扩增产物在591 bp附近有一条与预计大小相符的条带，见图3。

图3　敏感性试验结果

2.3 重复性试验

分别进行批内、批间重复性 PCR检测，两次试验的结果完全一致，见图4。

图4　重复性试验结果

2.4 符合性试验

对临床上疑似PPV感染的20份猪病料分别进行PCR检测、HA检测、病毒培养、IFA检测。结果见表1。

表1　符合性试验结果

2.5 病料检测结果

对215份样品进行检测，结果检出阳性样品25份，检出率为11.6%。部分样品PCR检测结果电泳图见图5。

3　讨论

3.1 关于PCR检测方法的建立

PCR技术是分子生物学技术中应用最为广泛的技术之一，以其敏感、特异、快速等优点，在疾病诊断及相关领域显示出巨大的优势和潜力［7-8］。为建立适应我国生猪PPV监测（包括诊断）的 PCR方法，本研究基于当前对PPV基因组分子生物学研究的现状，在对比众多株PPV VP2基因序列的基础上，设计了1对特异性检测引物，进行了最佳反应条件、检测特异性和敏感性试验，建立了PCR检测方法，并用于临床组织病料的检测。

图5　不同地区样品PPV PCR检测结果

特异性试验结果表明，所建立的PCR方法能特异性地扩增出PPV的部分VP2基因片段，而CSFV、PCV、PRRSV、PRV和阴性对照均未见目的条带，与预期结果完全相符；PCR敏感性试验结果显示，PPV参考毒株的DNA经10-1～10-8系列稀释，仍可检出特异性目的条带，说明该方法的敏感性很高。同时，无论批间还是批内重复性PCR检测均取得一致性结果，也说明本研究建立的PCR方法具有较好的重复性。此外，对实验室诊断中常用的猪细小病毒PCR、HA、病毒分离以及IHA等方法进行了符合性实验，结果发现PCR、IHA方法优于HA和病毒分离，从检测效率来看，PCR方法最优。

由于PCR方法具有较高的敏感性，在采集、保存及运输过程中应严格按照相关标准进行［9］，在实验室检测过程中应严格杜绝样本污染、气溶胶等污染的发生，以免出现假阳性结果［10］。同时，对PCR检测的阳性样品，在必要时还应进行病原分离鉴定，甚至测序，以获得最终确诊结果。但就临床发病检测或流行病学监测而言，本研究建立的PPV PCR方法具有特异性强、敏感性高等优点，能满足细小病毒感染临床诊断及疫情监测工作的需要。

3.2 样品检测结果分析

利用本研究建立的方法，对来自山东、河北等8省份不同猪场的215份临床疑似繁殖障碍猪群样品进行检测，检出PPV核酸阳性样品25份，检出率为11.63%。该结果表明，样品来源猪场的PPV感染较为严重，由此可能引起的母猪繁殖障碍等临床问题不容忽视。建议这些场应结合实际情况，做好免疫、消毒、保健等综合性防控工作，尽量减少由疫病带来的损失。

［1］ 殷震，刘景华. 动物病毒学［M］. 2版. 北京：科学出版社，1997.

［2］ Carwright S F，Huck A L. Viruses isolated in association with herd，infertility，abortious and stillbirths in pig［J］. Vet. Res，1967，81：196-197.

［3］ 黄良宗，梁金华，股万军. 猪细小病毒分子生物学及防制研究进展［J］. 黑龙江畜牧兽医，2003，（9）：64-65.

［4］ 候世宽，江曙光，孙恩贵，等. 猪细小病毒Mu-1株的分离鉴定［J］.中国人民解放军兽医大学学报，1984，3（4）：321-328.

［5］ 张晓根，甘孟侯，黄瑜，等. 间接Dot-ELISA检测猪细小病毒抗原的研究［J］. 中国兽医杂志，1994，20（12）：3-5.

［6］ 李文刚，甘孟侯. 聚合酶链反应检测猪细小病毒的研究［J］ 中国兽医杂志，1996，22（8）：3-5.

［7］ 赵俊龙，陈焕春，吕建强，等. 猪细小病毒PCR检测方法的建立与应用［J］. 中国兽医学报，2003，23（2）：142-143.

［8］ Mengeling W L，PauI P S. The relative importance of swine and contaminant premises as reservoirs of porcine parvovirus. Am［J］. Virol，2001，52（5）：654-690.

［9］ 尤永进，许泉兴，周智爱. 猪细小病毒研究近况［J］. 上海农业学报，1995，11（3）：90-96.

［10］ 蒋玉雯，冯军，黄安国，等. 猪细小病毒感染症在广西的流行与防制研究［J］. 中国兽医杂志，1994，20（8）：10-11.

（责任编辑：朱迪国）

Establishment and Application of PCR Methods for Porcine Parvovirus Detection

Zou Min，Li Lumei，Gong Xiao，Wang Hong，Yang Xubing，Fan Gencheng
（Qingdao Yebio Bioengineering Co.，Ltd.，State Key Laboratory of Animal Genetic Engineering Vaccine，Qingdao，Shandong 266114）

Based on the VP2 genomic sequence of porcine parvovirus that published in GenBank， a pair of primers were designed by the Primer5.0 software，and the target fragment of amplification was 591 bp. The PPV PCR detective method was established by specificity， sensibility，reproducibility and parallelism assay. The conformity test results showed that the PCR method was better than HA，VI and IHA. Using the method to test 215 clinical samples，there were 25 positive samples，with a detection rate of 11.63%. All Results showed that this method could be used in the diagnosis and epidemiological survey of PPV.

porcine parvovirus；VP2 gene；PCR；detection

S852.65

B

1005-944X（2016）08-0094-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.026

青岛市民生计划课题——猪细小病毒灭活疫苗的研制及产业化（12-4-1-42-nsh）

范根成

注：邹 敏、李陆梅对本研究具有同等贡献，并列第一作者