Shh信号通路阻断对人结肠癌细胞HT-29增殖、侵袭的影响及机制探讨
2016-09-05梁新军魏少忠
梁新军，魏少忠
(湖北省肿瘤医院，武汉430079)
Shh信号通路阻断对人结肠癌细胞HT-29增殖、侵袭的影响及机制探讨
梁新军，魏少忠
(湖北省肿瘤医院，武汉430079)
目的观察阻断Sonic Hedgehog(Shh)信号通路对人结肠癌细胞HT-29增殖和侵袭的影响，并探讨其机制。方法取对数生长期HT-29细胞分为A、B、C、D组，分别置于含0、5、10、20 μmol/L Shh信号通路特异性抑制剂Cyclopamine的培养基中培养。采用MTT法检测各组干预24、48、72 h时细胞增殖抑制率，采用Transwell法检测各组干预48 h时体外侵袭能力，采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Shh、下游转录因子GLI1 mRNA。结果干预24、48、72 h时各组细胞增殖抑制率为B组
结肠癌；Shh信号通路；下游转录因子；细胞增殖；细胞侵袭
结肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一，发病率已跃居全球恶性肿瘤的第3位，其发病机制目前尚不明确[1]。基因突变和表观遗传学改变等参与了结肠癌的发生、发展过程[2]。Sonic Hedgehog(Shh)信号通路是调控胚胎发育及细胞分化的重要通路，GLI1是其下游转录因子。研究发现，Shh信号通路在肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中呈激活状态，且与肿瘤的恶性程度和患者预后密切相关[3～5]。目前Shh信号通路在结肠癌中的具体作用机制的研究报道较少。2015年1～12月，我们观察了阻断Shh信号通路对人结肠癌细胞HT-29增殖和侵袭的影响，并探讨其在结肠癌发生、发展中的意义。现报告如下。
1 材料与方法
1.1材料HT-29购自美国ATCC公司，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养。胎牛血清、RPMI 1640培养基及TRIzol为美国Gibco公司产品；胰酶、DMSO、MTT、Shh信号通路特异性抑制剂Cyclopamine等购自Sigma公司；SYBR Premix EX Taq试剂盒购自Invitrogen公司；引物由上海吉玛公司合成；Transwell小室购自Corning公司；Bio-Rad iQ5实时荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司；Multiskan MK3全自动酶标仪购自Thermo公司。
1.2细胞分组及处理取对数生长期HT-29细胞，胰酶消化、重悬后分为A、B、C、D组，分别置于含0、5、10、20 μmol/L Cyclopamine的培养基中培养，每组6个复孔，均置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内培养。
1.3HT-29增殖情况观察采用MTT法。分别于干预24、48、72 h取对数生长期各组细胞，调整细胞密度5×104/mL。每孔200 μL接种于96孔板，每组6个复孔。培养24 h，加入20 μL的MTT(5 g/L)行MTT检测，所有操作均严格按照使用说明书进行。采用酶标仪检测各组490 nm波长处的吸光度值，计算增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100%。实验重复3次。
1.4HT-29侵袭能力观察采用Transwell法。干预48 h时取对数生长期各组细胞，1×105/mL培养在无血清的PRMI 1640培养基中，置于Transwell小室上室，下室每孔加入0.5 mL含10%胎牛血清的PRMI 1640培养基。置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，培养24 h。拭去上室表面剩余细胞，将迁移到下室的细胞用多聚甲醛固定30 min，Giemsa染色15 min；显微镜下计数，以穿膜细胞数表示细胞的侵袭能力。实验重复3次。
1.5细胞Shh、GLI1 mRNA检测采用实时荧光定量PCR法。干预48 h时取对数生长期各组细胞，照TRIzol试剂盒说明提取总RNA，逆转录合成cDNA。按照SYBR试剂盒说明进行实时荧光定量PCR，对Shh、GLI1的mRNA进行定量检测。引物采用Primer 5.0软件设计，具体如下：Shh上游引物5′-CCAACGTAGCCGAGAAGACC-3′，下游引物5′-TCC-CGTGTTTCCTCATCCT-3′；Gli1上游引物5′-TGAGGTGGGCAGGTTAGGA-3′，下游引物5′-CAGAGGGAGATGGGGTGTTTT-3′。内参GAPDH上游引物5′-TGTCCCCACCCCCAATGTATC-3′，下游引物5′-CTCCGATGC CTGCTTCACACCTT-3′。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
2 结果
2.1各组细胞增殖抑制率比较见表1。
表1 干预24、48、72 h时各组细胞增殖抑制率比较
注：与B组同时点比较，#P<0.05；与C组同时点比较，*P<0.05；与本组前一时点比较，△P<0.05。
2.2各组穿膜细胞数比较干预48 h时，A、B、C、D组的穿膜细胞数分别为(55.670±6.506)、(35.330±7.371)、(28.330±4.041)、(23.330±2.309)个。B、C、D组穿膜细胞数均低于A组(P均<0.05)，但B、C、D组间比较差异无统计学意义。
2.3各组Shh、GLI1 mRNA表达比较各组Shh、GLI1 mRNA的相对表达量均为A组>B组>C组>D组，P均<0.05。见表2。
表2 各组HT-29组织Shh、GLI1 mRNA相对表达量比较
注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05；与C组比较，ΔP<0.05。
3 讨论
目前认为结肠癌的发生是多因素、多步骤的复杂过程，基因突变和表观遗传学改变等均参与了结肠癌的侵袭与转移过程，但其确切机制尚不明确[6～8]。国内外学者已发现多个与结肠癌转移相关的基因，如VEGF、MMP-9等，并针对这些因子采取了包括药物、基因转染等多种方法进行调控，虽能取得部分抑制转移的效果，但结果尚不满意[9～11]。
Shh信号转导通路不仅在胚胎发育过程中发挥重要作用，也参与了组织修复和细胞再生以及肿瘤发生和发展的过程。目前认为，Shh信号转导通路主要由Hh信号肽、跨膜受体以及下游转录分子组成，通过复杂的信号转导过程将上游信号传递到核内，进一步促进下游基因的表达而参与细胞的各项调控过程[12,13]。研究表明，Shh信号转导通路的关键信号分子主要有Shh、跨膜蛋白受体Ptch、Smo及下游的转录因子Gli等。在Shh信号被激活后，Shh与跨膜蛋白受体Ptch(Ptch1、Ptch2)相结合，解除了其对Smo的抑制作用，继而传递信号至下游的Gli(Gli1、Gli2、Gli3)，Gli蛋白进入核内后进一步激活下游NF-κB、Bmi-1等因子的表达，从而参与调控细胞的增殖与凋亡过程。Shh信号可能通过多种机制参与调控恶性肿瘤细胞的增殖与侵袭[14，15]。Sharma等[16]研究发现，Shh信号可能与PI3K/Akt/mTOR信号共同参与了胰腺癌干细胞增殖和分化的调控过程，继而参与了胰腺癌的侵袭与转移。Giakoustidis等[17]研究认为，Shh信号、WNT/β-catenin信号及Notch信号等可能共同参与了肝癌侵袭与转移的过程。本研究前期研究发现，结肠癌中Shh信号通路呈异常激活状态，本研究发现，干预24、48、72 h时各组细胞增殖抑制率均为B组
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Effects of blocking Shh signaling pathway on proliferation and invasion of colon cancer cell line HT-29
LIANGXinjun,WEIShaozhong
(HubeiCancerHospital,Wuhan430079,China)
ObjectiveTo observe the effects of blocking Sonic Hedgehog (Shh) signaling pathway on the proliferation and invasion of colon cancer cell line HT-29 and to investigate the mechanism. MethodsHT-29 cells in the logarithmic phase were divided into groups A, B, C, and D and were cultured in the culture medium containing 0, 5, 10 and 20 mol/L Shh signaling pathway specific inhibitor Cyclopamine, respectively. The inhibitory rate of cell proliferation was detected by MTT method at 24, 48 and 72 h after the treatment of Cyclopamine. Transwell method was used to detect the invasive ability of each group at 48 h. The Shh and downstream transcription factor GLI1 mRNA in HT-29 cells was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. ResultsThe proliferation inhibition rate at 24 h, 48 h and 72 h: group B
colon carcinoma; Sonic Hedgehog signaling pathway; downstream transcription factor; cell proliferation; cell invasion
湖北省武汉市科技局科技计划项目(2013062301010813)；湖北省武汉市晨光计划(2015070404010204)。
梁新军(1976-)，男，博士，副主任医师，主要研究方向为肿瘤免疫。E-mail： doctorlxj@163.com。
10.3969/j.issn.1002-266X.2016.18.004
R735.3
A
1002-266X(2016)18-0012-03
2016-01-11)
