高效脱氮菌株的筛选、鉴定及氨氮降解特性的研究

丁少华，孙叶凤，阮佳骅，史吉平，孙俊松

(1上海华强环保设备工程有限公司，上海　201210;2 上海科技大学生命科学与技术学院，上海　201210;3 中国科学院上海高等研究院生物炼制实验室，上海　201210)



高效脱氮菌株的筛选、鉴定及氨氮降解特性的研究

丁少华1，孙叶凤1，阮佳骅1，史吉平2,3，孙俊松2,3

(1上海华强环保设备工程有限公司，上海201210;2 上海科技大学生命科学与技术学院，上海201210;3 中国科学院上海高等研究院生物炼制实验室，上海201210)

降低氨氮是水污染治理或污水处理的重要指标之一，微生物脱氮是非常环保有效的方法。本文从活性污泥中分离筛选出多株具有很强脱氮能力的微生物，其中活性最强的一株菌A2初步鉴定属于Comamonas属，属于一株肠杆菌。对菌株A2进行了生长和生物脱氮能力的系统研究，考察了不同氨氮浓度对生物脱氮效果的影响，结果表明：A2具有高效去除氨氮的能力，当培养基中氨氮浓度为100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L时，脱氮率分别为97%，88%，82%，79%。

污水治理；生物脱氮；菌种鉴定

工农业生产及生活排污带来的氨氮过量排放，造成我国包括主要的湖泊河流在内的各类自然水体的富营养化现象十分严重，直接导致水体的自净功能下降，BOD、COD等数据超标，带来严重的生态环境污染问题。自然水体中氨氮的去除主要依靠自养的氨氧化菌及硝化菌先将氨氧化，并由反硝化微生物进行硝酸及亚硝酸基团的还原脱氮过程，最终生成N2、NO或N2O等无机氮气体排放，从而实现生物圈的氮循环。然而目前我国许多自然水体中的氨氮的排放远超出自然环境所能承受的范围[1]，因此，研究和开发经济有效的生物脱氮工艺和方法，已成为亟待开展的重要研究课题，也是几十年来全世界的研究热点之一。虽然国内外对氨氧化工艺研究的比较多[2-3]，但对优良微生物的分离鉴定及以提高氨氮降解效率为目的的生理特性研究较少，本实验利用污水处理厂的活性污泥，进行高效微生物的分离筛选，获得多株氨氮高降解的菌株，并对其中一株进行了系统的除氨氮培养研究，分析了氨氮浓度等因素对其氨氮降解率的影响，该研究可以为水处理中的生物脱氮工艺提供微生物资源，并为中试应用提供实验依据。

1　实　验

1.1材料与培养基

筛选样品于2014年9月12采自常州某高浓度氨氮废水处理项目。

富集培养基[4]：(NH4)2SO42.0 g，NaCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，NaHCO31.6 g，加蒸馏水到1000 mL，pH值7.2。分离培养基：(NH4)2SO42 g，NaCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，琥珀酸钠·6H2O 24 g，pH值 7.0。固体培养基：补加2.0%琼脂，其他成分同分离培养基相同。

1.2仪器与试剂

超净工作台，上海智城分析仪器制造有限公司；移液枪，Eppendorf；台式摇床，上海智城分析仪器制造有限公司；恒温培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；紫外-可见分光光度计，Benkman Coulter；FD-1A-50冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；离子溅射仪，瑞士BA L-TEC公司；扫描电镜，荷兰FEI公司。

1.3　实验方法

1.3.1菌种的富集培养和分离纯化

1.3.2菌种的驯化及鉴定、电镜分析

将纯化得到的各菌种接种至分离培养基平板上，置30℃温箱培养2天，挑取长出的菌株接种到液体分离培养基中，并逐步增加分离培养基中(NH4)2SO4的量，使培养基中的氨氮浓度达到200 mg/L、400 mg/L，对初筛菌进行不断驯化，最终得到试验菌株。再根据《伯杰氏细菌鉴定手册》中有关细菌形态和生理生化等特性对分离出的菌株进行鉴定[6]。挑取单菌落采用细菌通用引物8f/1492r扩增菌株的16S rDNA片段，PCR反应体系和反应条件参照文献。获得的PCR产物经纯化后送生物公司(上海生工生物工程有限公司)测序，测序结果使用生物信息工具(NCBI网站上的BLASTn)比对，获得的同源序列再利用EZeditor和MEGA6软件进行遗传树分析。

扫描电镜的微生物样本前期处理如下：将过夜培养的菌株培养液先自然干燥，然后通过乙醇梯度脱水(分别为 30%、50%、70%、85%、90%乙醇各 1 次，100%乙醇 2 次，15 min/次)，再将样本经冷冻干燥机冷冻48 h后，经SCD005 离子溅射仪喷金100 s,再利用QUANTA 200 扫描电镜对电镜样本进行观察和记录。

将初筛菌种子液分别接种于内装100 mL分离培养基的250 mL 三角瓶中，摇床培养，每隔2 h取样，检测菌体生长，(以600 nm处的浊度OD600表示)，实验设置三个平行。同时测定在氨氮浓度在200 mg/L时的降解情况，能力最强的菌株记为试验菌。

2　结果与讨论

2.1脱氮微生物的富集与分离

图1　三株菌的生长曲线

图2　株菌的氨氮降解能力

污水厂的活性淤泥经经只含氨氮的培养基富集后，利用固体培养基分离到了3株微生物纯种单克隆，分别将这几株菌接种到分离培养基中，由图1、图2可以看出，这几株菌在营养贫瘠的分离培养基中均呈现良好的生长状态，从图1可以看出，随着培养时间的推移，每株菌达到稳定期的时间不同，其中菌株E对分离培养的适应性最佳；而从图2可以看出，当培养基中氨氮浓度为200 mg/L时，A2的氨氮降解率较D和E要高，因此后续对A2进行了系统地生物脱氮培养和菌株鉴定实验。

2.2实验菌株A2的电镜观察及分子鉴定

分离提纯后的A2菌在电镜观察中呈现梭状，长3～4 μm，宽约1～2 μm(图3)。同时，16S rDNA的测序结果经同源比对后输入生物分析软件Ezeditor(ver 1.0.23)，并导入MEGA6软件构建遗传树，结果如图4所示，证实这株菌的16S rDNA序列与Comamonas testosteroni(从毛单胞菌)的种属相似性最高，从而确定A2为丛毛单胞菌属。

图3　A2菌株的电镜图

图4　A2菌株的遗传树分析结果

2.3氨氮浓度对A2菌株的生物脱氮效果的影响

图5　不同氨氮浓度中丛毛单胞菌A2 降解能力的影响

3　结　论

研究表明，从污水处理厂淤泥中获取得到的几株微生物均有较好的生物脱氮能力，其中表现最好的一株微生物经分子生物学鉴定为丛毛单胞菌A2，其在在氨氮浓度范围100～400 mg/L时均具有很强的降解氨氮的能力，100 mg/L氨氮的营养液中，其氨氮降解率接近100%，而大部分河道池塘湖泊中的有机氮含量均低于100 mg/L，因此，丛毛单胞菌A2在这些污水环境中的生物治理中有着广阔的应用前景。

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[3]刘亚敏,郝卓莉.高氨氮废水处理技术及研究现状[J].水处理技术,2012(S1):7-11.

[4]张玲华,邝哲师,张宝玲.高效硝化细菌的富集培养与分离[J].浙江农业学报,2002,14(6):348-350.

[5]李君文,郑金来,晁福寰,等.一些硝化细菌的分离与鉴定[J].应用与环境生物学报,2004,10(6):786-789.

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[7]国家环保局水和废水监测分析方法编委会.水和废水监测分析方法.3版[M].北京:中国环境科学出版社,1989:260-263.

[8]水和废水监测分析方法编委会.水和废水监测分析方法.3版[M].北京:中国环境科学出版社,1997:272-274.

[9]Eckenfelder W.Industrial water pollution control.3rd Edition[M].USA:Mcgraw-hill Companies Inc,2000.

[10]蒋彬,吕锡武.生物脱氮除磷机理及技术进展[J].安全与环境工程,2005,12(3):74-77.

Effective Denitrifier Strains Screening,Identification and Research of Ammonia Nitrogen Degradation Characteristics

DING Shao-hua1,SUN Ye-feng1,RUAN Jia-hua1,SHI Ji-ping2,3,SUN Jun-song2,3

(1 Shanghai Huaqiang Environmental Protection Equipment & Engineering Co.,Ltd.,Shanghai 201210;2 School of Life Science and Technology,Shanghai Technology University,Shanghai 201210;3 Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences BiologicalRefining laboratory,Shanghai 201210,China)

Ammonia nitrogen concentration is one of important index in water quality control,biodegradation of ammonium nitrogen removal is a favorable way in water pollution treatment,which is a biological process involved various group of microorganisms.In this study,three strains with high capability in ammonia nitrogen degrading were isolated from activated sludge.Among of them,strain A2 demonstrated the highest activity in ammonia removal during growth in synthetic medium.A2 was preliminarily identified to belong to genus Comamonas,family of Comamonadaceae.The study also showed that removal of ammonia nitrogen was as high as 97%,88%,82%,79%when A2 was cultivated in medium containing ammonia at concentration of 100 mg/L,200 mg/L,300 mg/L or 400 mg/L,respectively.

water treatment; ammonia biodegradation; strain identification

X703,X52

A

1001-9677(2016)06-0075-03