Yes相关蛋白通过Wnt/β⁃catenin信号通路调控软骨细胞Sox9表达的研究

鲍远　黄俊明　吴颖星　陈琨　程鹏　郭风劲　陈安民

·实验研究论著·

Yes相关蛋白通过Wnt/β⁃catenin信号通路调控软骨细胞Sox9表达的研究

鲍远黄俊明吴颖星陈琨程鹏郭风劲陈安民

目的研究Yes相关蛋白（Yes⁃associated protein，YAP）通过Wnt/β⁃catenin信号通路调控软骨细胞Sox9表达的机制。方法用siRNA分别沉默YAP基因和Lats1基因来调控YAP的活性，通过Real⁃time PCR检测软骨特异性基因和Wnt/β⁃catenin信号通路下游基因的表达；通过Westernblot检测GSK3β的磷酸化水平、活化β⁃catenin的蛋白水平以及Sox9的蛋白水平；并通过阿利新蓝染色检测软骨细胞外基质的分泌情况。用siRNA沉默YAP基因后，再用氯化锂干预细胞，通过Westernblot检测Sox9的表达和GSK3β的磷酸化水平。结果沉默YAP基因后，磷酸化GSK3β和活化β⁃catenin的蛋白水平减少，c⁃Myc 和Nanog基因表达减少，Sox9、Col2和Aggrecan基因表达升高，并且软骨细胞分泌基质增多；沉默Lats1基因后，磷酸化GSK3β和活化β⁃catenin的蛋白水平增加，c⁃Myc和Nanog基因表达上调，Sox9、Col2和Aggre⁃can基因表达减少，并且软骨细胞分泌基质减少。此外，氯化锂可以阻断沉默YAP引起的Sox9表达上调。结论YAP通过Wnt/β⁃catenin信号通路调控软骨细胞Sox9的表达。

软骨细胞；细胞分化；Yes相关蛋白；信号传导；基因表达调控

关节软骨缺乏血管、神经、淋巴管和软骨前体细胞，再生修复能力十分有限［1，2］。创伤导致的关节软骨缺损若长期存在，易进展为骨性关节炎并引起关节疼痛和功能障碍。近年来，软骨组织工程兴起，为关节软骨缺损修复带来新的希望［3］。然而，研究发现软骨细胞在体外培养时很容易发生去分化而成为肥大软骨细胞，移植后由于失去分泌软骨基质的功能，无法形成正常的软骨组织［4］。因此，如何维持离体软骨细胞的正常表型是软骨组织工程修复关节软骨缺损的重大挑战。

Yes相关蛋白（Yes⁃associated protein，YAP）是一种调控细胞增殖、生长和分化的转录协同因子［5，6］，Hippo信号通路下游的效应蛋白。在哺乳动物中，Hippo信号通路被激活后，Lats将下游的YAP磷酸化而使其滞留在胞质中，从而使YAP的功能受到抑制；通路被抑制后，Lats的活性降低使YAP的磷酸化程度减少，非磷酸化的YAP进入细胞核与相关转录因子结合，最终启动目的基因的表达［7］。在胚胎干细胞中，YAP高水平的表达有助于促进干细胞增殖并保持未分化的状态［8］；在间充质干细胞（MSCs）中，YAP过表达会抑制它向软骨细胞分化，因此YAP是MSCs成软骨分化的负性调控因子［9］。

Sox9是软骨细胞分化过程中的一种必不可少的转录因子［10］，可抑制软骨细胞去分化［11，12］。研究证明，Sox9和β⁃catenin相互作用共同调控软骨细胞的分化［13］。β⁃catenin是经典Wnt信号通路下游的效应蛋白［14］，过表达β⁃catenin（或通过氯化锂抑制β⁃catenin的降解）能导致软骨细胞去分化而成为肥大软骨细胞，降低β⁃catenin的表达则可促进软骨细胞分化并抑制软骨细胞发生肥大现象［15］。有学者研究指出，β⁃catenin能与Sox9的C端转录激活域结合，从而抑制Sox9启动目的基因的转录［13］。

近年来有文献报道，YAP参与Wnt/β⁃catenin信号通路的调节［16］。胞质中的YAP能与β⁃catenin降解复合体结合，从而增加复合体的活性并促进β⁃catenin的降解；而YAP激活后与复合体脱离并进入胞核，从而抑制复合体的活性并激活β⁃catenin［17］。因此我们推测，YAP通过Wnt/β⁃catenin信号通路对Sox9的表达进行调控。

材料与方法

一、实验材料

7日龄SD大鼠（华中科技大学同济医学院实验动物中心，中国），Ⅰ型胶原酶、凝胶配置试剂盒、RI⁃PA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、SDS⁃PAGE蛋白上样缓冲液5×、GAPDH抗体（武汉博士德生物工程有限公司，中国），胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），DMEM/F12（HyClone公司，美国），总RNA提取试剂盒、SYBR Green试剂（Azanno公司，瑞典），逆转录试剂盒（东洋纺上海生物科技有限公司，中国），非磷酸化β⁃catenin（Active β⁃catenin）、YAP、磷酸化YAP抗体（CST公司，德国），Sox9、Lats1抗体（Abcam公司，英国），siRNA及riboFECTTMCP转染试剂（广州锐博生物科技有限公司，中国），电泳仪、电转膜仪、实时荧光定量PCR仪和凝胶成像分析系统（Bio⁃Rad公司，美国）。

二、实验方法

（一）细胞的分离培养

将7日龄SD大鼠处死后，在无菌条件下剪下双下肢，剔除皮肤肌肉等软组织。取胫骨上端静止层的生长板软骨，用显微剪刀将其剪成1～2 mm的碎块，加入0.25%的胰酶在37℃水浴中消化20 min，离心弃去上清后再加入0.2%的Ⅰ型胶原酶，最后将其放入37℃、5%CO2的培养箱内消化8 h。消化得到的软骨细胞通过离心获取（1 200 r/min，5 min），弃去上清后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12重悬，再放入培养箱内培养，次日更换培养基。当细胞融合度达到80%～90%时，用胰酶消化并按1∶3的比例传代，备用。

（二）siRNA沉默Lats1和YAP基因

软骨细胞经过胰酶消化后，接种至6孔板，每孔细胞数约为20万个，次日待细胞贴壁后进行siRNA转染。

（1）稀释RNA，取5 μl siRNA（20 μmol/L）储存液加入到120 μl riboFECTTMCPbuffer（1×）中，轻轻混匀。

（2）混合液制备，加入12 μl riboFECTTMCP Re⁃agent，轻轻吹打混匀，室温孵育10 min。

（3）弃去6孔板内陈旧培养基后，加入1 863 μl新鲜培养基，再加入上述混合液137 μl，轻轻摇匀。

转染成功后，通过Real⁃time PCR验证最佳的沉默序列（表1）。

表1　沉默Lats1和YAP基因的siRNA序列

（三）Westernblot检测蛋白表达

按照上述转染步骤分别将Lats1和YAP基因沉默，96 h后提取蛋白。用RIPA裂解液裂解细胞，收集细胞裂解液后，在低温高速离心机中离心20 min （4℃，12 000×g）。然后吸取上清液，用BCA蛋白定量试剂盒测定其蛋白浓度，剩余上清液按4∶1的比例加入SDS⁃PAGE蛋白上样缓冲液，充分混匀后在沸水浴中煮5 min，室温冷却后置于-20℃保存。

蛋白样本各取20 μg加入10%的SDS⁃PAGE凝胶中，通过电泳把不同分子量的蛋白分离。在恒流300 mA持续2 h的条件下，将蛋白转移至孔径为0.45 μm的PVDF膜上。用5%的BSA（TBST溶液配制）在室温下封闭2 h。然后PVDF膜用规定稀释比例的一抗在4℃下孵育过夜。一抗孵育后，将PVDF膜用TBST溶液洗3次，每次在水平摇床上摇10 min。然后将PVDF膜在室温下孵育相应二抗1 h，再用TBST洗3次，每次在水平摇床上摇10 min。最后目的蛋白用ECL和凝胶成像分析系统检测，并用内置软件（Image Lab 5.1版本）处理图像结果。

（四）Real⁃time PCR检测基因表达

按照上述转染步骤分别将Lats1和YAP基因沉默，72 h后用总RNA提取试剂盒提取样本总RNA，总RNA浓度由分光光度计测得。取1 μg各样本的RNA分别加入逆转录试剂盒的反应体系，在逆转录仪器中进行逆转录生成cDNA后，置于-20℃保存。逆转录反应条件为：42℃，15 min；95℃，5 min；4℃，30 min。取样本cDNA进行Real⁃time PCR，反应体系为10 μl，包括0.5 μl样本、4 μl无RNA酶水、0.5 μl引物和5 μl SYBR Green。反应程序为：95℃预变性2 min；95℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，该步骤循环40次；溶解曲线。

RNA相对表达量由内置软件（Bio⁃Rad iQ5光学系统软件）计算得出。

（五）阿利新蓝染色

按照上述转染步骤分别将Lats1和YAP沉默，于7 d后进行阿利新蓝染色。染色步骤：①弃去培养基，PBS洗2遍后用4%多聚甲醛固定30 min；②弃去4%多聚甲醛，用PBS洗3遍，再用阿利新蓝染液染30 min；③PBS洗3遍后，在显微镜下观察。

图1　沉默YAP基因后检测软骨特异性基因及Wnt/β⁃catenin信号通路下游基因的表达　a：用Real⁃time PCR检测3条YAP基因沉默序列的沉默效果，siYAP⁃1的沉默效果最好；b：沉默YAP基因后，Wnt/β⁃catenin信号通路下游基因c⁃Myc和Nanog的表达明显减少；c：沉默YAP基因后，软骨特异性基因Sox9、Col2和Aggrecan的表达显著升高

结果

一、沉默YAP基因促进软骨特异性基因的表达

分别用siYAP⁃1、siYAP⁃2、siYAP⁃3转染软骨细胞，通过Real⁃time PCR检测YAP基因沉默的效果。结果显示siYAP⁃1的沉默效果最好（图1a）。

然后用siYAP⁃1转染软骨细胞，通过Real⁃time PCR检测Wnt/β⁃catenin信号通路下游基因和软骨特异性基因的表达情况，结果显示c⁃Myc和Nanog基因的表达下调（图1b），提示Wnt/β⁃catenin信号通路的活性受抑制；同时Col2、Sox9和Aggrecan基因的表达上调（图1 c）。

用Westernblot检测GSK3β蛋白的磷酸化水平（GSK3β磷酸化后，GSK3激酶活性被抑制）以及活化β⁃catenin和Sox9的蛋白水平。结果显示，沉默YAP基因导致GSK3β的磷酸化水平降低，活化β⁃catenin蛋白水平减少，而Sox9蛋白水平增多（图2）。此外，阿利新蓝染色显示沉默YAP基因后细胞外基质的染色面积大于对照组（图3），说明软骨细胞分泌基质增加。

二、沉默Lats1基因抑制软骨特异性基因的表达

分别用siLats1⁃1、siLats1⁃2、siLats1⁃3转染软骨细胞，通过Real⁃time PCR检测Lats1基因沉默的效果，结果显示siLats1⁃2的沉默效果最好（图4a）。

然后用siLats1⁃2转染软骨细胞，通过Real⁃time PCR检测Wnt/β⁃catenin信号通路下游基因和软骨特异性基因的表达情况，结果显示c⁃Myc和Nanog基因的表达明显上调（图4b），提示Wnt/β⁃catenin信号通路被激活；同时Col2、Sox9和Aggrecan基因的表达减少（图4 c）。用Westernblot检测YAP和GSK3β蛋白的磷酸化水平以及活化β⁃catenin和Sox9的蛋白水平，结果显示，沉默Lats1基因导致YAP蛋白的磷酸化水平降低（说明YAP蛋白活性升高）而GSK3β的磷酸化水平升高，同时活化β⁃catenin蛋白水平增多，而Sox9蛋白水平减少（图5）。此外，阿利新蓝染色显示沉默Lats1基因后细胞外基质的染色面积小于对照组（图3）。

三、沉默YAP引起的Sox9表达上调可被氯化锂抑制

阴性对照（NC）组细胞和YAP基因沉默（siYAP）组细胞分别用GSK3激酶抑制剂氯化锂干预3 d，通过Westernblot检测磷酸化GSK3β和Sox9的蛋白水平，结果显示，单纯沉默YAP基因时，GSK3β的磷酸化水平减少，而Sox9的蛋白表达增加。氯化锂作用后，两组细胞的GSK3β磷酸化水平均明显升高，即GSK3激酶的活性被抑制，而Sox9的表达均明显减少（图6）。说明氯化锂可通过抑制GSK3激酶的活性来阻断沉默YAP基因引起的Sox9表达上调。

图3　阿利新蓝染色检测软骨基质的分泌情况（×100） 沉默YAP基因后，软骨细胞分泌细胞外基质增多；而沉默Lats1基因后，软骨细胞分泌细胞外基质减少

图4　沉默Lats1基因后检测软骨特异性基因及Wnt/β⁃catenin信号通路下游基因的表达　a：用Real⁃time PCR检测3条Lats1基因沉默序列的沉默效果，可见siLats1⁃2的沉默效果最好；b：沉默Lats1基因后，Wnt/β⁃catenin信号通路下游基因c⁃Myc和Nanog的表达明显升高；c：沉默Lats1基因后，软骨特异性基因Sox9、Col2和Aggrecan的表达显著减少

讨论

体外培养的软骨细胞容易发生去分化是阻碍软骨组织工程发展的难题，因此揭示体外软骨细胞去分化的机制有助于解决这一问题。在本研究中，我们通过沉默Lats和YAP基因的方法来调节YAP蛋白的活性，同时观察软骨细胞特异性基因Sox9、Col2和Aggrecan的表达情况，从而证明YAP蛋白活性与软骨细胞出现去分化现象之间的关联；并且通过观察Wnt/β⁃catenin信号通路的变化，揭示YAP调控Sox9表达的可能机制。

图5　沉默YAP基因后，p⁃GSK3β和Active β⁃catenin的蛋白水平升高，说明β⁃catenin降解复合体活性被抑制，而Wnt/β⁃catenin通路被激活，同时，Sox9的表达减少

图6　阴性对照组细胞和沉默YAP基因的细胞分别用GSK3激酶抑制剂氯化锂干预，检测GSK3β激酶的活性以及Sox9的表达　单纯沉默YAP基因时，GSK3β的磷酸化水平减少，而Sox9的表达增加；氯化锂作用后，两组细胞GSK3β的磷酸化水平均升高，而Sox9表达均减少；说明氯化锂可通过抑制GSK3激酶的活性来阻断沉默YAP基因引起的Sox9表达上调

研究结果显示，沉默Lats1基因导致Sox9的表达明显减少，而沉默YAP基因导致Sox9的表达明显增多。Lats1蛋白是Hippo信号通路中的具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白，能使YAP蛋白中第127位点的丝氨酸残基磷酸化，从而抑制YAP蛋白的活性使其定位在胞质中［18］。沉默Lats1基因后，YAP蛋白的磷酸化程度减少且活性升高；而沉默YAP基因后，YAP蛋白表达减少因此活性被抑制。该结果表明YAP蛋白的活性与Sox9的表达具有相关性。细胞在体外培养时，改变基质的硬度可以调节YAP蛋白的活性。增加基质硬度可导致YAP蛋白活性增加，反之，YAP蛋白活性减小。有学者通过改变基质硬度来证明YAP蛋白活性与Sox9表达水平之间的关系，其结论与我们一致［19］。当细胞增殖活跃时，YAP的活性处于较高的状态，所以我们推测，软骨细胞在体外增殖过程中，YAP活性增高导致Sox9表达减少，最终导致软骨细胞去分化而失去软骨表型。

然后，我们研究了YAP调控Sox9表达的机制。通过沉默Lats1基因来上调YAP的活性，结果显示GSK3β的磷酸化水平增高（即GSK3激酶的活性被抑制），活化β⁃catenin的蛋白水平增加，以及Wnt信号通路下游基因的表达增加；通过沉默YAP基因来抑制YAP的活性，结果显示GSK3β的磷酸化水平降低（即GSK3激酶的活性升高），活化β⁃catenin的蛋白水平降低，以及Wnt信号通路下游基因的表达减少。该研究结果证明上调YAP的活性可以激活Wnt/β⁃catenin信号通路，而降低YAP的活性可以抑制Wnt/β⁃catenin信号通路。Azzolin等［17］认为，YAP调控Wnt/β⁃catenin信号通路的位点在β⁃catenin降解复合体，胞浆中的YAP与复合体结合并招募β⁃TrCP，从而促进磷酸化β⁃catenin的降解来抑制β⁃catenin的活性。然而我们在实验中发现，改变YAP的活性后，GSK3激酶的活性也随之变化，因此我们推测YAP可能是通过影响GSK3激酶的活性来调控β⁃catenin的活性，进而调控Sox9的表达。为了进一步证明这个观点，我们在沉默YAP基因后用GSK3激酶抑制剂氯化锂作用细胞。结果显示单纯沉默YAP基因时，GSK3β的磷酸化水平减少（即GSK3激酶活性升高），且Sox9蛋白水平增加；然而，当沉默YAP基因同时给予氯化锂作用，此时GSK3β的磷酸化水平增加（即GSK3激酶活性降低），并且Sox9蛋白水平减少。说明氯化锂可通过抑制GSK3激酶的活性来阻断沉默YAP基因引起的Sox9表达上调，因此证明YAP通过影响GSK3激酶的活性来调控Wnt/β⁃catenin信号通路，进而调节Sox9的表达。有关YAP在Wnt/β⁃catenin信号通路中的直接作用位点，本研究未能证明，需要进一步探索。

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Yes⁃associated protein regulates the expression of Sox9 in chondrocytesby Wnt/β⁃catenin signaling pathway.

BAO Yua
n，HUANG Junming，WU Yingxing，CHEN Kun，CHENG Peng，GUO Fengjin，CHENanmin. Department of Orthopaedics，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Scienceand Tech⁃nology，Wuhan 430030，China

CHENanming，E⁃mail：anminchen@hust.edu.cn

ObjectiveTo investigate the mechanisms of Sox9 regulatedby Yes⁃associated protein （Yap）in chondrocytes via Wnt signaling pathway.MethodsYap or Lats1 was knocked down with small inter⁃fering RNA to regulate theactivity of Yap.Genes related to Wnt/β⁃catenin signaling pathwayand cartilage⁃spe⁃cific genes were detectedby Real⁃time PCR.Wnt/β⁃catenin signaling was determinedby detection of p⁃GSK3βandactive β⁃catenin via Westernblottingand Sox9 wasalso detectedby Westernblotting.The cartilage⁃specif⁃ic extracellular matrix wasassessedbyalcianblue staining.Chondrocytes with Yap knockdown were treated with lithium chloride，then p⁃GSK3βand Sox9 were detectedby Westernblotting.ResultsAfter knockdown of Yap，Wnt signaling pathway was inhibited，leading to increased expression of Sox9，Col2andaggrecanand enhanced secretion of the cartilage⁃specific extracellular matrix.After Lats1 was knocked down，the obtained re⁃sult was opposite completely.Moreover，lithium chloride couldblock the up⁃regulation of Sox9 expression in⁃ducedby knockdown of Yap.ConclusionYap regulates the expression of Sox9 in chondrocytesby Wnt signal⁃ing pathway.

Chondrocytes；Cell differentiation；Yes⁃associated protein；Signal transduction；Gene ex⁃pression regulation

10.3969/j.issn.1674⁃8573.2016.03.012

国家自然科学基金（81171696，81472082）

430030武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科

陈安民，E⁃mail：anminchen@hust.edu.cn

2015⁃12⁃11）