β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇逆转运的影响及机制*

李秀英，叶　云（西南医科大学附属医院药剂科，四川泸州646000）

·论著·

β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇逆转运的影响及机制*

李秀英，叶云△（西南医科大学附属医院药剂科，四川泸州646000）

目的探讨β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇逆转运的影响及相关机制。方法采用氧化低密度脂蛋白（oxLDL）诱导的RAW264.7巨噬细胞为泡沫细胞模型，给予β-葡聚糖进行干预。通过油红O染色及酶比色法定量检测细胞内总胆固醇和胆固醇酯水平的变化；采用Western blotting及实时定量PCR检测β-葡聚糖对巨噬细胞ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）及其mRNA表达的影响并进行统计分析。同时采用蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理细胞4、8、12 h测定ABCA1稳定性。结果与oxLDL处理组比较，β-葡聚糖对巨噬细胞摄取脂质的抑制率为 （90.0±1.8）%，oxLDL处理组巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇酯及总胆固醇与β-葡聚糖处理组 （2.5、5.0、10.0 μg/mL β-葡聚糖+oxLDL共同孵育）比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；5.0、10.0 μg/mL β-葡聚糖处理组巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1及其mRNA表达与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01或0.05）。β-葡聚糖（10.0 μg/mL）与CHX共同处理组在细胞孵育4、8、12 h时，ABCA1降低水平均小于CHX处理组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论β-葡聚糖通过增加ABCA1的表达水平及增强其稳定性，促进细胞内胆固醇的排出，最终抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。

β葡聚糖类；巨噬细胞；胆固醇；泡沫细胞；胆固醇酯；动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是冠状动脉疾病的主要危险因素，是发达国家人群致死、致残的首要病因，在发展中国家其发生率也逐渐呈增高趋势［1］。脂质含量丰富的巨噬细胞源性泡沫细胞是动脉粥样硬化损伤形成的标志，也是导致动脉粥样硬化损伤的原因［2］。巨噬细胞泡沫化与巨噬细胞大量摄取氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、细胞内胆固醇排出障碍及细胞内大量蓄积胆固醇酯（CE）有关［3］。胆固醇逆转录受体ATP结合盒转运蛋白 A1（ABCA1）负责将巨噬细胞内胆固醇排出［4］。有研究结果显示，增加ABCA1的表达可以抑制泡沫细胞的形成，并最终延缓动脉粥样硬化的发生、发展［5-6］。

β-葡聚糖主要来源于新鲜的食品，如燕麦、啤酒酵母等。有研究显示，β-葡聚糖具有降低血脂、抗氧化、预防动脉粥样硬化的作用［7］，但具体机制尚不清楚。本研究拟从ABCA1表达变化的角度探讨β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇排出的影响，为β-葡聚糖抗动脉粥样硬化作用机制的研究和临床应用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞RAW264.7巨噬细胞（美国ATCC细胞库），由重庆医科大学生命科学院提供。

1.1.2试剂油红O（规格：5 g，批号：215-295-3）、甘油明胶（规格：100 mL，批号：G5516，纯度：≥99%）、β-葡聚糖（规格：25 mg，批号：P1120100）均购自美国Sigma公司；ABCA1（ab18180）、β-actin（ab8226）抗体购于美国Abcam公司；DMEM培养基（规格：500mL，批号：1740266）、胎牛血清（规格：200 mL，批号：150202）购自Gibco公司；oxLDL（规格：2 mg，批号：2015-12-22）购自广州奕源生物公司。

1.1.3仪器H1650-W台式高速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；ESCO垂直流超净工作台（北京五洲东方科技发展有限公司）；BBD6220 CO2培养箱（美国Thermo Fisher公司）；IX71-A21PH倒置显微镜（日本Olympus公司）；DHP-9402电热恒温培养箱［德创科仪（北京）科技有限公司］；Fluoroskan Ascent FL酶标仪（美国Thermo Forma公司）；GelDoc XR+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养及冻存RAW264.7巨噬细胞复苏后，使用DMEM培养基加10%胎牛血清置于含5%CO2、37℃的培养箱进行培养，0.25%胰酶消化传代，当传至第5代时可将细胞用于实验。取对数生长期细胞，消化、离心、稀释细胞至密度为2×106mL-1，分装于冻存管中，置于-80℃冰箱中，过夜后转至液氮罐保存。

1.2.2噻唑蓝（MTT）法检测细胞活性RAW264.7巨噬细胞接种于96孔板中，将细胞分成对照组及β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）干预组。每组3个复孔，待细胞生长良好后，β-葡聚糖干预组分别加入浓度为2.5、5.0、10.0 μg/mL的β-葡聚糖，培养24 h后，加入20 μL MTT孵育4 h，加入二甲亚砜（DMSO）120 μL，振荡10 min，在波长570 nm处检测吸光度A570nm。

1.2.3油红O染色检测细胞内脂质含量将RAW264.7巨噬细胞接种于6孔板内，分为对照组、oxLDL处理组（100 μg/mL oxLDL孵育24 h）、β-葡聚糖处理组（5.0 μg/mL β-葡聚糖及100 μg/mL oxLDL共同孵育24 h）。细胞孵育结束后，弃上清液，10%多聚甲醛固定30 min，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗1次后，油红O染色10 min，再用60%异丙醇洗涤细胞1次（孵育时间10 s），弃异丙醇，PBS轻轻洗1次后显微镜下照相。

1.2.4细胞内总胆固醇（TC）及CE含量测定将RAW264.7巨噬细胞接种于 6孔板内，分为对照组、oxLDL处理组（100 μg/mL oxLDL孵育24 h）、β-葡聚糖处理组（2.5、5.0、10.0 μg/mL β-葡聚糖及100 μg/mL oxLDL共同孵育24 h），细胞孵育结束后，收集细胞，1 000 r/min离心4 min，弃上清液，加入80 μL无水乙醇，超声提取10 s后，10 000 r/min离心5 min，吸上清液至EP管中，按照试剂盒说明书分别测定细胞内TC及CE含量。

1.2.5Western blotting检测ABCA1的表达及其蛋白稳定性（1）ABCA1表达量的测定：将处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞分为对照组、β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）处理组，孵育24 h后，收集细胞，加入细胞裂解液裂解细胞并提取蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。25 μg蛋白样品与上样缓冲液混合后煮沸10 min，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳100 V恒压2 h，湿转300 mA恒流1.5 h，5%脱脂奶粉封膜1 h，磷酸盐缓冲液+0.1%吐温-20（PBST）漂洗 3次后分别加入一抗和 β-actin 4℃孵育过夜，PBST漂洗3次，37℃二抗 （1∶1000稀释）反应1 h后进行电化学发光（ECL）显色。以β-actin作为内参，计算目的蛋白的表达量。（2）对于ABCA1稳定性的测定：将处于对数生长期的RAW264.7细胞分为对照组、蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理组、10.0 μg/mL β-葡聚糖与2.0 μg/mL CHX共同处理组，孵育时间为4、8、12 h，收集孵育后的细胞，按照上述方法检测ABCA1的变化。

1.2.6荧光定量PCR检测ABCA1 mRNA表达将处于对数生长期的RAW264.7巨噬细胞分为对照组、β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）处理组，孵育 24 h后，用Trizol提取细胞RNA，经Takara逆转录试剂盒合成cDNA，再通过引物进行荧光定量PCR扩增。所用引物包括：β-actin上游：5′-TTGTCCCTGTATGCCTCTGG-3′；βactin下游：5′-TTGTCCCTGTATGCCTCTGG-3′；ABCA1上游：5′-GGTTTGGAGATGGTTATACAATAGTTGT-3′，ABCA1下游：5′-CCCGGAAACGCAAGTCC-3′，实验结果用β-actin的mRNA标准化。

1.3统计学处理应用SPSS10.0统计软件进行数据分析，实验数据以±s表示，采用双尾t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1不同质量浓度β-葡聚糖对RAW264.7巨噬细胞活性的影响β-葡聚糖质量浓度为2.5、5.0、10.0 μg/mL时，检测所得A570nm值分别为3.68±0.06、3.68±0.06、3.69± 0.07，与对照组（3.65±0.05）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。2.5、5.0、10.0 μg/mL的β-葡聚糖对RAW264.7巨噬细胞的活性无影响，因此，在后续实验中选取的β-葡聚糖质量浓度为2.5、5.0、10.0 μg/mL。

2.2不同质量浓度β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响oxLDL处理组巨噬细胞源性泡沫细胞内CE及TC含量明显增加，与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；oxLDL+β-葡聚糖（2.5、5.0、10.0 μg/mL）处理组TC及CE含量与oxLDL处理组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1　不同质量浓度β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响（±s，mg/dL，n=3）

表1　不同质量浓度β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响（±s，mg/dL，n=3）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与oxLDL处理组比较，bP＜0.05。

胆固醇对照组　o x L D L处理组o x L D L + 2 . 5 μ g / m L β-葡聚糖处理组o x L D L + 5 . 0 μ g / m L β-葡聚糖处理组o x L D L + 1 0 . 0 μ g / m L β-葡聚糖处理组T C C E 3 6 2 . 0 ± 1 9 . 0 2 1 6 . 0 ± 1 2 . 0 6 5 1 . 6 ± 2 0 . 0a3 2 4 . 0 ± 1 5 . 0a3 9 8 . 2 ± 2 8 . 0b2 5 9 . 2 ± 2 0 . 0b3 2 5 . 8 ± 2 5 . 0b2 4 1 . 9 ± 2 8 . 0b2 8 9 . 6 ± 3 0 . 0b1 9 4 . 4 ± 1 7 . 0b

2.3β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响

对照组细胞内聚集的脂质较少，oxLDL处理组细胞内脂质明显增多，油红O染色后阳性细胞数为对照组的（5.00± 0.07）倍，与oxLDL处理组比较，5.0 μg/mL β-葡聚糖处理细胞后，细胞内脂质聚集减少，油红O染色后阳性细胞减少（90.0±1.8）%。见图1。

图1　β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响（油红O染色，400×）

2.4β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1及其mRNA表达的影响2.5、5.0、10.0 μg/mLβ-葡聚糖处理组ABCA1表达显著高于对照组，5.0、10.0μg/mLβ-葡聚糖处理组ABCA1 mRNA表达显著高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01或0.05），见表2、3，图2。

表2　β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达的影响（±s，n=3）

表2　β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达的影响（±s，n=3）

注：与对照组比较，aP＜0.01。

组别对照组β-葡聚糖处理组（μ g / m L ）2 . 5 5 . 0 1 0 . 0 A B C A 1 / β -a c t i n 1 . 5 0 ± 0 . 0 5 1 . 8 0 ± 0 . 0 6a1 . 9 5 ± 0 . 0 8a2 . 2 5 ± 0 . 0 4a

表3　β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1 mRNA表达的影响（±s，n=3）

表3　β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1 mRNA表达的影响（±s，n=3）

注：与对照组比较，aP＜0.05。

组别对照组β-葡聚糖处理组（μ g / m L ）2 . 5 5 . 0 1 0 . 0 A B C A 1 m R N A 1 . 7 0 ± 0 . 0 6 1 . 8 7 ± 0 . 0 5 1 . 9 5 ± 0 . 0 7a2 . 1 0 ± 0 . 0 8a

图2　β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达的影响

2.5β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞 ABCA1稳定性的影响β-葡聚糖（10.0 μg/mL）与CHX共同处理组在细胞孵育4、8、12 h时，ABCA1降低水平均小于CHX处理组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4、图3。

表4　β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1稳定性的影响（±s，n=3）

表4　β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1稳定性的影响（±s，n=3）

注：与CHX处理组相同时间点比较，aP＜0.05。

组别　0 h　4 h　8 h　1 2 h C H X处理组C H X + β-葡聚糖处理组1 . 3 0 ± 0 . 0 4 1 . 3 0 ± 0 . 0 4 0 . 3 9 ± 0 . 0 3 0 . 6 5 ± 0 . 0 5a0 . 2 6 ± 0 . 0 6 0 . 5 2 ± 0 . 0 3a0 . 2 4 ± 0 . 0 2 0 . 3 0 ± 0 . 0 3a

图3　β-葡聚糖对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1稳定性的影响

3　讨　论

已有研究表明，β-葡聚糖有降血脂、预防动脉粥样硬化的作用［7］。但β-葡聚糖是否减少巨噬细胞内CE的聚集及相关机制鲜见报道。本研究结果显示，β-葡聚糖通过促进巨噬细胞胆固醇逆转运受体ABCA1的表达及增强ABCA1蛋白稳定性，减少巨噬细胞内CE的聚集，抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。

胆固醇逆转运受体介导的巨噬细胞内胆固醇的排出在维持巨噬细胞胆固醇处于平衡状态过程中起着重要作用［4］。本研究结果证明了β-葡聚糖通过减少巨噬细胞内CE及TC含量，抑制巨噬细胞对oxLDL的摄取，从而抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成。此外，β-葡聚糖显著增加巨噬细胞ABCA1及其mRNA的表达。量化β-葡聚糖对ABCA1变化的影响发现，10.0 μg/mL β-葡聚糖增加ABCA1的表达量（50%，2.25/1.50）大约为β-葡聚糖介导的ABCA1 mRNA升高量（24%，2.10/1.70）及β-葡聚糖稳定ABCA1表达量（25%，0.30/0.24）的总和，该结果表明β-葡聚糖是通过调控ABCA1逆转录水平及转录后水平增加ABCA1的表达。ABCA1是巨噬细胞排出胆固醇的主要胆固醇逆转运受体［4］。此外，ABCA1在维持巨噬细胞内胆固醇平衡的重要作用已经得到公认［8-9］。由ABCA1的功能可知，β-葡聚糖增加ABCA1表达的作用与β-葡聚糖减少巨噬细胞内CE及TC含量，最终抑制巨噬细胞源性泡沫细胞的形成有关。

综上所述。本研究提供了β-葡聚糖抗动脉粥样硬化的新机制，同时也为抗动脉粥样硬化提供了治疗靶点。

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Effects of β-glucan on reverse cholesterol transport of macrophage-derived foam cells and its mechanism*

Li Xiuying，Ye Yun△（Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveTo explore the effects of β-glucan on the reverse cholesterol transport of macrophage-derived foam cells and its relative mechanism.MethodsOxidized low-density lipoprotein（oxLDL）induced RAW264.7 macrophages were adopted as the foam cells model for giving the β-glucan intervention.The Oil-red O staining and enzymatic colorimetry were employed to examine the changes of intracellular total cholesterol and cholesteryl ester；Western blotting and real-time PCR were used to detect the effect of β-glucan on the expression on ATP-binding cassette transporter protein A1（ABCA1）and mRNA in macrophages.The obtained data were statistically analyzed.The protein synthesis inhibitors cycloheximide（CHX）processed cell 4，8，12 h，thus，deter minated ABCA1 stability.ResultsThe inhibiting rate of β-glucan on macrophage′lipid uptake was（90.0± 1.8）%，total cholesterol and cholesteryl ester levels had statistical difference between the oxLDL group and the co-incubation groups of oxLDL and 5.0，10.0 μg/mL β-glucan（P＜0.05）；the expression of ABCA1 and mRNA had statistical differences between the 5.0，10.0 μg/mL β-glucan groups and the control group（P＜0.01 or 0.05）.β-glucan（10.0 μg/mL）and CHX common treatment group in cell incubation 4，8，12 h，ABCA1 lower level less than CHX treatment group，the difference was statistically significant （P＜0.05）.Conclusionβ-glucan promotes the intracellular cholesterol discharge and finally inhibits the formation of macrophagederived foam cells by enhancing ABCA1 expression and protein stability.

Beta-glucans；Macrophages；Cholesterol；Foam cells；Cholesterol esters；Atherosclerosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.14.001

A

1009-5519（2016）14-2117-03

国家青年自然科学基金项目（81500357）；西南医科大学附属医院课题项目（15044）；西南医科大学课题项目（2015-03-10）。

李秀英（1987-），博士研究生，主管药师，主要从事动脉粥样硬化发病机制研究。

△，E-mail：yeyun8622@163.com。

（2016-04-07）