实时荧光定量PCR技术在手足口病病原体检测中的临床应用

赵凯丽，王　芳，林　牧，龚亚东（贵州航天医院儿科，贵州遵义563000）

实时荧光定量PCR技术在手足口病病原体检测中的临床应用

赵凯丽，王芳，林牧，龚亚东△（贵州航天医院儿科，贵州遵义563000）

目的探讨实时荧光定量PCR（FQ-PCR）技术在手足口病（HFMD）病原体检测中的应用，了解遵义市HFMD流行特征。方法收集2015年5～7月该院儿科初步诊断为HFMD的85例患儿的咽拭子、疱疹液标本，采用FQPCR检测标本中肠道通用型病毒（EV-U）、肠道病毒71型（EV71）及柯萨奇病毒A组16型（CoxA16），同时与酶联免疫吸附试验（ELISA）检测结果进行比较分析。结果85例HFMD患儿采用FQ-PCR法检出65例EV-U阳性，阳性率为76.5%，其中2岁以下年龄段患儿阳性40例，阳性率为80.0%（40/50），2～5岁患儿阳性25例，阳性率为71.4%（25/35）。ELISA法检测EV-U阳性52例，其中2岁以下年龄段患儿阳性31例，阳性率为62.0%（31/50），2～5岁年龄段患儿阳性21例，阳性率为60.0%（21/35）。2种方法检测阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论FQ-PCR技术以其灵敏度高、特异性强、速率快等特点更适用于临床检测HFMD病原体。2015年遵义市HFMD病原体以EV71较多，其次是CoxA16。

手足口病；肠道病毒属；传染病控制；感染；聚合酶链反应

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是由肠道病毒引起的一种急性传染病，其具有较强的流行能力、传染性及复杂的传播媒介方式等特点，多发于学龄前儿童，尤以5岁以下年龄段发病率最高，是危害儿童健康的主要疾病。HFMD典型的临床表现为手、足、口腔等部位出现不同程度的皮肤黏膜皮疹、疱疹、溃疡，甚至可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等严重并发症［1］，尤以重症患儿病情发展快，易危及生命。有20多种（型）可引起HFMD的肠道病毒，其中以肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）最为常见［2］，尽管这2种病毒的遗传背景差异不大，但EV71感染引起重症病例的概率较高。虽然多种肠道病毒均可引起HFMD，但不同类型的病毒引起的疾病过程也有很大差异。传统的实验室检查一般采用病毒分离培养和血清学方法来确诊HFMD病原体，病毒分离培养耗时较长，需要4～15 d，而常用的肠道病毒组合血清并不能包括D血清型，如CoxA16和EV71等，且对技术要求过于苛刻，很难保证在暴发疫情时及时确诊。实时荧光定量PCR（FQ-PCR）是一种利用PCR法对核酸快速高效扩增的技术，具有操作方便、特异性强和灵敏度高等优点，本文采用FQPCR技术对贵州航天医院儿科住院的2～5岁初步诊断为HFMD的患儿进行病原体检测，以评估该检测方法在HFMD病原体检测中的临床应用价值。

1　资料与方法

1.1一般资料参照第7版《实用儿科学》的诊断标准，选取2015年5～7月本院儿科初步诊断为HFMD的85例患儿作为研究对象。85例患儿中男45例，女40例；年龄7个月至5岁，其中2岁以下50例，2～5岁35例。在征得家长同意的情况下，分别采集入选患儿咽拭子标本85份，疱疹液标本25份。标本采集使用无菌拭子，采集完毕后立即将标本置于病毒保养液中，并于-20℃保存。

1.2仪器与试剂PCR核酸扩增检测仪采用美国Applied Biosystems real time 7500（ABI 7500）；HFMD病原体检测试剂有HERQ020124-3B EV71、CA16及通用型肠道病毒核酸检测试剂盒，均由江苏默乐生物科技有限公司提供，均通过国家食品药品管理局（FDA）认证并注册批准生产应用于临床检测。诊断标准以该类相关试剂盒的核酸检测阳性结果为准。酶联免疫吸附试验（ELISA）所用EV71 IgG及CoxA16 IgG检测试剂由北京万泰生物技术有限公司提供。

1.3方法FQ-PCR法取原始样本200 μL，采用固相提取法中的柱式提取法提取RNA，并用PCR核酸扩增检测仪ABI 7500进行扩增，按照相关试剂说明书进行温度条件及循环扩增参数配置，同时设置不同浓度梯度定量品及阴性、阳性对照。严格按照相关试剂盒说明书进行ELISA操作。

1.4统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.12种方法检测结果比较采用FQ-PCR法检测85例初步诊断为HFMD患儿的咽拭子标本发现，肠道通用型病毒（EV-U）阳性 65例，阳性率 76.5%（65/85）；其中2岁以下年龄段患儿阳性40例，阳性率为80.0%（40/50），2～5岁年龄段患儿阳性25例，阳性率为71.4%（25/35）；2岁以下年龄段患儿EV-U阳性率高于2～5岁年龄段患儿，差异有统计学意义（P＜0.05）。EV-U阳性的65例患儿中EV71阳性40例，阳性率为61.5%（40/65），CoxA16阳性25例，阳性率为38.5%（25/65）。在不同类型样本的检测比较中，咽拭子样本阳性率为60.0%（51/85），疱疹样本阳性率为72.0%（18/25）。ELISA检测EV-U阳性52例，其中2岁以下年龄段患儿阳性31例，阳性率为62.0%（31/50），2～5岁年龄段患儿阳性21例，阳性率为60.0%（21/35）；其中EV71阳性20例，阳性率为38.5% （20/52），CoxA16阳性12例，阳性率为23.1%（12/52）。FQ-PCR法检测EV-U的阳性率高于ELISA法，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2FQ-PCR检测的标准曲线扩增曲线处（除未出现特异性扩增的阴性对照曲线外）大致分为3种形态：（1）循环阈值（Ct值）从12个循环开始上扬的曲线，形状呈标准的“S”形，说明该样本中含有的RNA病毒拷贝数很高；（2）Ct值从22～26个循环开始呈上扬的曲线，形状基本呈“S”形，说明该样本中含有的RNA病毒拷贝数较高；（3）Ct值从30个循环开始呈上扬的曲线，形状暂无法看出呈“S”形，但若再经过数个循环后便会呈现“S”形曲线，说明该样本中含有一定拷贝数的RNA病毒，可诊断为HFMD阳性。见图1。

图1　Taq酶探针FQ-PCR检测阳性标本的标准曲线

3　讨　论

多种人肠道病毒引起的HFMD是一种全世界范围内严重危害儿童健康的传染病，柯萨奇病毒是被新西兰最早发现的HFMD病毒，Robinson和Rhodes 2位加拿大学者在1958年首次从患者中分离出柯萨奇病毒［3］，1972年EV71也被美国发现属于HFMD病毒［4］。传播速度快、较强的流行能力和传染性及复杂的传播方式能在较短的时间内大规模流行，可通过消化道和呼吸道进行传染［5］，一旦流行疫情难以控制。我国原卫生部在2008年5月2日将HFMD列入《中华人民共和国传染病防治法》规定的丙类传染病。该病病原体为肠道病毒，主要是EV71及CoxA16。EV71感染患儿常伴严重的神经系统并发症，且EV71感染的危害性最大，致死率最高。自限性HFMD多因CoxA16感染所引起，一般预后较好，发生严重并发症和死亡的概率极低［6］。

目前，HFMD病原体检测一般采用病毒培养、血清学检测和FQ-PCR检测、逆转录PCR（RT-PCR）检测等技术，其传统的诊断以临床表现为主要手段，早期检测常为阴性。RT-PCR多次扩增的检测方式易出现假阳性，交叉污染等存在操作繁琐易污染等缺点，且对检测CoxA16的灵敏度不够高［7］。本研究选取85例本院儿科初步诊断为HFMD的患儿为研究对象，采用FQ-PCR技术对患儿85份咽拭子标本和25份疱疹液标本进行EV71及CoxA16检测，结果显示，EV-U检出阳性率为76.5%，具有较好的检测灵敏度，这可能与不同类型的标本有关［8］。本研究结果表明，FQ-PCR较ELISA法的检测灵敏度更高。阳性样本患儿发病7d内的传染能力最强，7～14 d从咽部可检测到病毒，21～35 d从粪便中可检测到病毒，一般疱疹液中存有大量病毒，其中一些治愈的患儿在其排出的粪便中检测出病毒的生存周期可达数月［9］。

本研究检测为EV-U阳性的65例患儿中，EV71感染阳性40例，CoxA16阳性25例，说明在贵州省遵义地区HFMD的发病以EV71感染为主，这与文献报道的贵州省流行病学特征相符合［10］。本研究中疱疹液标本阳性率为72.0%（18/25）高于咽拭子的60.0% （51/85），但因咽拭子采集操作步骤简便、无创伤、不抽血等特点，患儿及家长均较易于接受，所以实验室推荐采用咽拭子标本采集法。

通过对EV71、CoxA16感染病例的对比分析发现，EV71与CoxA16引起的HFMD在临床表现等方面差异不大，但EV71易致脑干脑炎及神经源性肺水肿，可能危及生命。因此，采用FQ-PCR技术进行HFMD病原体检测显得尤为重要，其具有不易污染、特异性好、操作简单等优点，能够在HFMD疫情暴发和临床患儿感染的早期做出高通量、快速诊断。此外，FQ-PCR技术在HFMD病原体潜伏期即能区分是否感染，对于HFMD的及时监测和防控具有重要作用。

［1］许文波，檀晓娟.肠道病毒71型疫苗使用策略［J］.中华预防医学杂志，2014，48（6）：443-444.

［2］高宁，党双锁，李梅.肠道病毒71型手足口病致神经系统发病机制的最新进展［J/CD］.中华实验和临床感染病杂志：电子版，2012，6（2）：162-164.

［3］顾红岩，李兴旺.EV71和CoxA16病毒的区别与联系［J/CD］.中华实验和临床感染病杂志：电子版，2014，8（1）：120-124.

［4］周丽玲.肠道病毒71型与手足口病的研究进展［J］.中国妇幼保健，2013，28（3）：562-564.

［5］周建芳，杨珊明，汪亚芬.126例肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组共感的临床特征分析［J］.中国医药指南，2014，12（22）：148-149

［6］杨小兵，孔德广，余滨.武汉市2008-2011年手足口病流行特征分析［J］.中国预防医学杂志，2013，14（3）：209-212.

［7］王敏，周小蓟，陈露.实时荧光PCR技术在手足口病检测中的应用［J］.中国卫生检验杂志，2013，23（3）：679-681.

［8］张群，杨蕾，曹伟峰.实时荧光聚合酶链反应检测患儿手足口病病原体［J］.检验医学，2012，27（5）：416-418.

［9］高勇，韩明锋，李秀勇，等.阜阳市2011年手足口病实验室检测结果分析［J］.检验医学，2013，28（9）：796-800.

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Clinical application of real-time fluorescence quantification PCR technology in HFMD pathogen detection

Zhao Kaili，Wang Fang，Lin Mu，Gong Yadong△（Department of Pediatrics，Guizhou Aerospace Hospital，Zunyi，Guizhou 563000，China）

ObjectiveTo investigate the application of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （FQ-PCR）technology in hand-foot and mouth disease（HFMD）pathogens detection，and to understand the HFMD epidemic characteristics in Zunyi City.MethodsThe throat swabs and herpes liquid samples were collected from 85 children patients with preliminarily diagnosed HFMD in the pediatric department of our hospital.EV-U，EV71 and coxsackievirus A 16（CoxA16）were detected by using the FQ-PCR technology，meanwhile the obtained results were compared with those detected by ELISA.Results

Among 85 cases of HFMD，65 cases of EV-U positive were detected by FQ-PCR，the positive rate was 76.5%，in which 40 cases were in the age group of less than 2 years old，the positive rate was 80.0%（40/50），25 cases were in the age group of 2-5 years，the positive rate was 71.4%（25/35）.Fifty-two cases of EV-U positive were detected by ELISA，in which 31 cases were the age group of under 2 years old，the positive rate was 62.0%（31/50），21 cases were in the age group of 2-5 years，the positive rate was 60.0%（21/35），the difference between these two kinds of method was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe FQ-PCR technology of HFMD pathogen detection is more suitable for the clinical application due to the characteristics of high sensitivity，strong specificity and high speed.The HFMD pathogens in Zunyi City during 2015 are mainly EV71，followed by CoxA 16.

Hand，foot and mouth disease；Enterovirus；Communicable disease control；Infection；Polymerase chain reaction

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.15.012

A

1009-5519（2016）15-2310-02

赵凯丽（1973-），副主任医师，主要从事儿科临床工作。

△，E-mail：747755680@qq.com。

（2016-03-24）