Sox9 mRNA在软骨肉瘤去分化过程中的意义

刘百奇，孟祥龙，张　昊，车德馨，王国文，韩金刚（.齐齐哈尔市第一医院急诊创伤外科，黑龙江6005；.天津医科大学附属肿瘤医院骨与软组织肿瘤科，天津300060）

Sox9 mRNA在软骨肉瘤去分化过程中的意义

刘百奇1，孟祥龙1，张昊1，车德馨1，王国文2，韩金刚1（1.齐齐哈尔市第一医院急诊创伤外科，黑龙江161005；2.天津医科大学附属肿瘤医院骨与软组织肿瘤科，天津300060）

目的探讨Sox9 mRNA在软骨肉瘤去分化过程中所起的作用，并分析其与各临床病理参数的关系。方法利用免疫组织化学方法检测Sox9 mRNA在人普通软骨肉瘤与去分化软骨肉瘤间的差异表达及其与临床病理参数的关系。结果与正常软骨组织比较，Sox9 mRNA在普通软骨肉瘤中表达上调，在去分化软骨肉瘤中表达下调；Sox9 mRNA在软骨肉瘤各分级之间表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；Sox9 mRNA的阳性表达差异与年龄、性别、部位无关（P＞0.05），而与肺转移、有无复发有关，且肺转移及复发者阳性率明显高于无肺转移、无复发者，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论Sox9 mRNA与软骨肉瘤的发生、发展、转移及预后有关。

软骨肉瘤；免疫组织化学；细胞去分化；肿瘤复发；肿瘤转移；预后

Sox9 mRNA是许多组织和器官发生、发展所需的重要基因，也是软骨细胞分化和软骨形成的重要转录因子［1-2］。Sox9 mRNA已被确定在软骨肉瘤中表达［3］，但对其在软骨肉瘤中的表达差异及在软骨肉瘤发生、发展中所起作用的研究甚少。软骨肉瘤中约90%是普通型软骨肉瘤，恶性程度属于低、中度，去分化软骨肉瘤是在低度恶性软骨肉瘤或内生软骨瘤的基础上，出现了含有骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤等高度恶性成分的肿瘤。普通软骨肉瘤一般预后较好，而多数去分化软骨肉瘤患者死于广泛转移。如何提高软骨肉瘤患者生存率、减少复发转移是临床医生急需解决的难题。检测Sox9 mRNA在不同分型软骨肉瘤中的表达差异有助于揭示其与肿瘤发生、发展、预后的关系，为靶向治疗提供可能性。本研究利用分子生物学手段检测Sox9 mRNA在不同分型软骨肉瘤组织标本中的表达差异，为软骨肉瘤去分化后进展快、预后差提供理论依据，并为软骨肉瘤的诊断、治疗提供新方法。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1组织来源软骨肉瘤石蜡包埋标本来自天津市肿瘤防治重点实验室，经病理检查确诊，其中包括普通软骨肉瘤组织标本20例，去分化软骨肉瘤组织标本20例；另有正常软骨组织标本20例。

1.1.2试剂Sox9mRNA兔多克隆抗体（Santacruz公司）；链霉素抗生物素-过氧化物酶（SP）免疫试剂盒（Sigma公司）。DAB显示试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2方法

1.2.1操作方法将蜡块进行常规切片、脱蜡、水化、抗原修复等处理，严格按照SP免疫试剂盒要求操作。Sox9 mRNA阳性细胞主要定位于细胞质及细胞膜。根据染色细胞阳性比例及染色强度，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

1.2.2结果判定免疫组织化学阳性率计算方法：每张切片在400倍光学显微镜下随机选取10个高倍视野，以阳性细胞比例的平均值为阳性率，然后对结果进行评分：阳性率小于或等于10%为0分，＞10%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%为3分；再按染色强度加以评分：无染色为0分，浅黄色为1分，棕褐色为2分，深褐色为3分。将二者相乘作为最后评分：0分记为阴性，≥1分记为阳性。最终分别计算出Sox9mRNA在正常软骨、普通软骨肉瘤、去分化软骨肉瘤中表达的阳性率，以及Sox9 mRNA在不同临床参数间表达的阳性率。

1.3统计学处理应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，软骨肉瘤不同分级中Sox9 mRNA的表达差异采用Kruskal-Wallis秩和检验（H检验），各临床参数间Sox9 mRNA表达差异采用χ2检验。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1Sox9 mRNA在软骨肉瘤组织和正常软骨组织中的表达在正常软骨组织中，Sox9 mRNA基本存在于软骨细胞核中；在普通软骨肉瘤和去分化软骨肉瘤中，Sox9 mRNA基因除在细胞核中表达外，细胞质内也有少量表达。在普通软骨肉瘤中，Sox9 mRNA表达水平高于正常软骨组织，在去分化软骨肉瘤中，Sox9 mRNA表达水平低于正常软骨组织。与正常软骨组织比较，Sox9 mRNA在普通软骨肉瘤中表达上调，在去分化软骨肉瘤中表达下调。见图1。

图1　Sox9 mRNA在不同类型软骨肉瘤组织和正常软骨组织中的表达（SP法，400×）

2.2Sox9 mRNA在软骨肉瘤各分级中的表达Sox9 mRNA在20例正常软骨组织中表达11例，阳性率为55.0%；在20例普通软骨肉瘤中表达18例，阳性率达90.0%；在20例去分化软骨肉瘤中的表达8例，阳性率仅为40.0%。经统计分析，Sox9 mRNA在软骨肉瘤各分级之间表达水平比较，差异有统计学意义（H=9.077，P＜0.05）。见表1。

表1　Sox9 mRNA在软骨肉瘤各分级中的表达

2.3软骨肉瘤中Sox9 mRNA与临床参数之间关系

40例软骨肉瘤标本中，Sox9 mRNA阳性表达26例，总阳性率为65.0%。进一步分析发现，Sox9mRNA的阳性表达差异与年龄、性别、部位无关（P＞0.05），与肺转移、有无复发有关，且肺转移及复发者阳性率明显高于无肺转移、无复发者（P＜0.01）。见表2。

表2　软骨肉瘤中Sox9 mRNA与临床参数之间关系

3　讨　论

软骨肉瘤是由软骨发生的恶性骨肿瘤，是继骨肉瘤之后第二常见的原发性恶性骨肿瘤，约占原发性骨恶性肿瘤的40%，具有极其复杂的临床病理特征［4］。软骨肉瘤通常发生在10～80岁的男性，肿瘤一般通常出现在肩胛骨、肋骨、胸骨或骨盆等部位［5］，其对化疗和放射治疗不敏感［6］，所以广泛的局部切除仍是目前主要的治疗方式。部分患者通常在手术切除后，因局部侵犯及远处转移预后较差［7］，其生存率与尤文氏肉瘤和骨肉瘤相比显著下降［8］。普通软骨肉瘤预后一般较好，5年生存率可达60%，去分化软骨肉瘤预后较差，患者多死于广泛的远处转移。Sox9 mRNA是软骨形成过程中一个非常重要的调节蛋白，指导软骨特异性基因的表达，从而调节软骨组织的发育生长。最近研究报道显示，Sox9 mRNA基因功能丧失可导致人类软骨肉瘤细胞凋亡，说明在软骨肉瘤中Sox9 mRNA发挥着致癌的作用［9］。Sox9 mRNA在多种类型的肿瘤中可增加肿瘤细胞增殖、入侵、迁移的能力［10］，多种生存和预后较差的实性瘤体与Sox9mRNA的过度表达相关［11-12］。

本研究应用免疫组织化学方法探讨不同分级软骨肉瘤之间Sox9mRNA基因表达差异，结果显示，Sox9mRNA表达在去分化软骨肉瘤和普通软骨肉瘤之间存在显著性差异。与正常软骨组织比较，Sox9 mRNA在普通软骨肉瘤组织中高表达，而在去分化软骨肉瘤组织中低表达，而且这种差异表达与肿瘤的肺转移、复发相关。这可能也是去分化软骨肉瘤和普通软骨肉瘤预后不同的原因之一。但Sox9 mRNA基因在软骨肉瘤的发生、发展及去分化过程中所起的具体作用尚不清楚，需进一步研究证实。因此，从目前得到的信息来看，有效控制和干扰Sox9 mRNA的表达可能抑制肿瘤的发生和发展。

［1］Oh CD，Lu Y，Liang S，et al.SOX9 regulates multiple genes in chondrocytes，including genes encoding ECM proteins，ECM modification enzymes，receptors，and transporters［J］.PLoS One，2014，9（9）：e107577.

［2］Bobick BE，Chen FH，Le AM，et al.Regulation of the chondrogenic phenotype in culture［J］.Birth Defects Res C Embryo Today，2009，87（4）：351-371.

［3］Söderström M，Böhling T，Ekfors T，et al.Molecular profiling of human chondrosarcomas for matrix production and cancer markers［J］.Int J Cancer，2002，100（2）：144-151.

［4］Leddy LR，Holmes RE.Chondrosarcoma of bone［J］.Cancer Treat Res，2014，162（6）：117-130.

［5］Pescador D，Blanco J，Corchado C，et al.Chondrosarcoma of the scapula secondary to radiodermatitis［J］.Int J Surg Case Rep，2012，3（4）：134-136.

［6］Kalinski T，Sel S，Kouznetsova I，et al.Heterogeneity of angiogenesis and blood vessel maturation in cartilage tumors［J］.Pathol Res Pract，2009，205（5）：339-345.

［7］Tsou HK，Chen HT，Hung YH，et al.HGF and c-Met interaction promotes migration in human chondrosarcoma cells［J］.PLoS One，2013，8（1）：e53974.

［8］Chen PC，Cheng HC，Yang SF，et al.The CCN family proteins：modulators of bone development and novel targets in bone-associated tumors［J］. Biomed Res Int，2014，2014：437096.

［9］Ikegami D，Akiyama H，Suzuki A，et al.Sox9 sustains chondrocyte survival and hypertrophy in part through Pik3ca-Akt pathways［J］.Development，2011，138（8）：1507-1519.

［10］Dynoodt P，Speeckaert R，De Wever O，et al.miR-145 overexpression suppresses the migration and invasion of metastatic melanoma cells［J］. Int J Oncol，2013，42（4）：1443-1451.

［11］Xia S，Feng Z，Qi X，et al.Clinical implication of Sox9 and activated Akt expression in pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Med Oncol，2015，32（1）：358.

［12］Bruun J，Kolberg M，Nesland JM，et al.Prognostic significance of β-Catenin，E-Cadherin，and SOX9 in colorectal cancer：results from a large Population-Representative series［J］.Front Oncol，2014，4：118.

Significance of Sox9 mRNA in dedifferentiation process of chondrosarcoma

Liu Baiqi1，Meng Xianglong1，Zhang Hao1，Che Dexin1，WangGuowen2，HanJingang1（1.Department of Emergency Trauma Surgery，Qiqihaer Municipal First Hospital，Heilongjiang 161005，China；2.Department of Bone and Soft Tissue Tumor，Affiliated Tumor Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300060，China）

ObjectiveTo investigate the role of Sox9 mRNA in differentiation process of chondrosarcoma，and to analyze its relation with clinical pathological parameters.MethodsThe expression difference of Sox9 mRNA between common chondrosarcoma and differentiated chondrosarcoma and its relation with the clinical pathological parameters were detected by using the immunohistochemical method.ResultsCompared with normal cartilage tissue，Sox9 mRNA was up-regulated in common chondrosarcoma and down-regulated in differentiated chondrosarcoma；the Sox9 mRNA expression level had statistical difference among different grades of chondrosarcoma（P＜0.05）；the positive difference of Sox9 mRNA expression had no relation with the age，gender and site（P＞0.05），while had relation with the lung metastasis and recurrence，moreover the positive rate in the patients with lung metastasis and recurrence was significantly higher than that in the patients without lung metastasis and recurrence，the difference was statistically significant（P＜0.01）.ConclusionSox9 mRNA is related with occurrence，progression，metastasis and prognosis of chondrosarcoma.

Chondrosarcoma；Immunohistochemistry；Cell dedifferentiation；Neoplasm recurrence；Neoplasm metastasis；Prognosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.15.006

A

1009-5519（2016）15-2292-02

刘百奇（1980-），硕士研究生，主治医师，主要从事骨外科临床工作。

（2016-03-11）