菲立磁标记兔骨髓基质细胞自体移植坐骨神经的研究

何骁，邓莉莉，邹康（.郴州市第一人民医院中心医院骨科一区，湖南43000；.郴州市第一人民医院北院/儿童医院儿科，湖南43000）

菲立磁标记兔骨髓基质细胞自体移植坐骨神经的研究

何骁1，邓莉莉2，邹康1
（1.郴州市第一人民医院中心医院骨科一区，湖南423000；2.郴州市第一人民医院北院/儿童医院儿科，湖南423000）

目的在合适示踪剂帮助下，采用无创伤性影像学技术来在体识别、跟踪移植后骨髓基质细胞（BMSCs）的存活状态及与宿主神经组织整合情况，了解BMSCs移植周围神经后细胞如何迁移、如何凋亡和如何被吸收。方法BMSCs原代分离培养、诱导，菲立磁标记、鉴定及传代后注入坐骨神经损伤的兔模型中，并于细胞移植后第1、2、4、8、16周分别行磁共振成像（MRI）、透射电镜及免疫组织化学等。结果将菲立磁标记的干细胞移植后，采用MRI技术对兔坐骨神经进行扫描发现，以T1加权像（T1WI）和T2加权像（T2WI）序列检查可见移植菲立磁-多聚赖氨酸（FE-PLL）标记干细胞的坐骨神经区有明显低信号改变，T2WI扫描序列信号较T1WI明显。结论兔BMSCs源神经干细胞移植后，可在坐骨神经内存活、迁移、分化，T2WI序列成像可清晰显示菲立磁标记的BMSCs所致的低密度影像改变。利用MRI可以对移植后的标记细胞进行初步活体追踪。

移植，自体；坐骨神经；磁共振成像；菲立磁；骨髓基质细胞

【Abstract】Objective To adopt the non-invasive imaging technology in the help of suitable tracermaterial to in vivo recognize and track the survivalstatus of post-trans plantbone marrow stromal cells（BMSCs）and integration condition of hostnervous tissue，to understand themigration，apoptosis and absorption of cells after bonemarrow stromal cells autotransplant into peripheral nerve.M ethods BMSCs were primarily isolated，cultured，induced，Feridex labeled，identified and injected into the rabbitmodelof sciatic nerve injury after passage.Then MRI，transmission electron microscope and immunohis tochemicalex aminations were performed at1，2，4，8 and 16 weeks after cell transplantation.Results After Feridex labeled stem cell trans plantation，MRI scanning on rabbitsciatic nerve found that the obvious low signal change in the sciatic nerve area of FE-PLL labeled stem cells could be seen by the T1W1 and T2W1 sequence examinations，moreover the sequence signal of T2W1 scanningwas more significant than T1W1.Conclusion Theneuralstem celloriginated from rabbit BMSCs can survive，migrateand different iate after trans plantation.The T2W1 sequence imaging can clearly display the changeof low density imaging caused by Feridex labeled BMSCs.Using MRI can conduct thepreliminary in vivo trackingon labeled cellsafter transplantation.

【Keywords】Transplantation，autologous；Sciatic nerve；Magnetic resonance imaging；Feridex；Stromal cell

近年来干细胞疗法已成为治疗多种疾病的新策略，其目的是替代、修复及加强受损组织或器官的生物学功能。随着干细胞研究的深入，有关骨髓基质细胞（bonemarrow stormal cells，BMSCs）移植修复神经系统损伤的研究也越来越多。本研究拟在合适示踪剂帮助下，采用无创伤性影像学技术来在体识别、跟踪移植后BMSCs的存活状态及与宿主神经组织整合情况，从而了解BMSCs移植周围神经后细胞如何迁移、凋亡、被吸收及被谁吞噬。最终为其进一步行体内自体移植治疗的实验应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物选取2～3月龄，体质量为1.5～2.0 kg的新西兰兔（由南华大学动物中心提供）。

1.1.2试剂与仪器菲立磁（PE）试剂盒（Advanced Magnetic公司）；碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF，R＆D公司）；白血病抑制因子（LIF）、细胞表皮因子（EGF）、PKH67染料试剂盒、3，3-二氨基苯联胺试剂盒（DAB）、淋巴细胞分离液；FITC标记山羊抗小鼠IgG、生物素标记山羊抗小鼠IgG试剂盒（Sigma公司）；兔神经巢蛋白（Nestin）抗体、鼠抗单克隆神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体（Santa Cruz公司）；神经干细胞培养基（南方医科大学实验室配制，专利号：02134314.4）。

1.1.3主要仪器外科手术器械：手术剪、弯剪、镊子、血管钳、显微器械1套、缝针、无菌注射器等医用超导磁共振仪（荷兰PHILIP电器公司）。

1.2方法

1.2.1兔骨髓采集、BMSCs的分离、扩增及分化鉴定将兔用水合氯醛静脉注射麻醉后，无菌条件下于兔股骨处抽取骨髓约4mL。所获骨髓用Hank′s液稀释，细胞悬液与淋巴细胞分离液按1∶2比例混合，2 500 r/min密度梯度离心15min。吸取富含核细胞的界面层，加入1～2mL双蒸水吹打，加入干细胞培养基，800 r/min离心约5min，小心去除上清液后加相同体积培养基，并加1%胎牛血清及LIF（10 ng/mL）及bFGF（10 ng/mL），接种于培养板和培养瓶中，培养5 d，见图1、2。培养细胞均经4%多聚甲醛固定，磷酸缓冲液（PBS）冲洗，一抗4℃孵育过夜，室温孵育显色剂染色呈棕色的细胞为阳性。以抗原表达鉴定神经干细胞、分化形成的神经元、分化形成的胶质细胞，见图3、4。

图1　相差显微镜下培养8 h的BMSCs细胞形态（200×）

图2　第3代BMSCs细胞形态（200×）

图3　相差显微镜下神经元样多突起细胞形态（400×）

图4　相差显微镜下类神经元细胞NSE免疫组织化学检测结果（400×）

1.2.2PE体外标记BMSCs将FE（50μg/mL）和多聚赖氨酸（PLL，1.5μg/mL）混合，振荡30min，将FE-PLL混合物1∶1加入体外扩增培养诱导后观察存活良好的细胞培养基中。在37℃下培养10 d左右，室温下用0.25%胰蛋白酶消化，用含血清培养基终止反应并悬浮细胞，1 000 r/min离心5min，去除上清液，用神经干细胞培养液调整细胞密度为1.0×106μL-1，置40℃备用，见图5。

图5　相差显微镜下FE标记BMSCs普鲁士蓝染色（200×）

1.2.3兔坐骨神经损伤模型的建立将兔称质量、麻醉，碘酒、乙醇消毒后，铺一次性手术巾。随机选择移植侧及对照侧，行髋关节后入路，依次切开皮肤、皮下，分离臀部肌肉显露并保护坐骨神经，显露坐骨神经分支处，并在其上方约8mm处向上切开坐骨神经外膜，锐性切除约8mm长神经。将肌膜缝合包裹神经外膜以加强对移植干细胞的包裹力。移植的神经干细胞用微量注射器在5min内注入兔坐骨神经缺损区内，对照侧注射DMEM培养液。最后再用明胶海绵包裹，在皮肤外标记实验组移植侧。术后清洁笼具，给予青霉素以预防感染，并观察动物的生命体征。

1.2.4磁共振成像（MRI）检查于细胞移植后第1、2、4、8、16周分别行MRI检查。检查时，动物麻醉后俯卧位固定于有机玻璃板上，采用荷兰PHILIP电器公司医用超导磁共振仪常规定位后进行T1加权像（T1WI）和T2加权像（T2WI）序列检查。

2　结果

移植前台盼兰染色显示活细胞数在96%左右。T2WI扫描序列信号较T1WI明显，细胞移植1周时低信号改变区比较局限，见图6a。但经包裹的骨髓源性神经干细胞稍有外渗，移植4、8周后低信号改变增大，见图6b。移植16周后MRI检查未能发现明显低信号改变。

图6　细胞移植1、8周后MRI检查结果

3　讨论

周围神经损伤残疾率高、治疗困难，是常见的临床问题［1］，给社会及家庭带来沉重的负担。而作为一种新的治疗神经系统损伤方法——体外分离培养获得的BMSCs移植正成为神经科学研究的热点［2-3］。

由于BMSCs具有来源广泛、强大的再生及分化潜能、体内移植反应弱、移植后可以在体内分化出神经元和神经胶质细胞，补充因各种原因导致的神经元和神经胶质细胞的丢失［4］等优点，因此，BMSCs移植治疗一直是人们探索的目标。

经研究发现周围神经与BMSCs有很大关系［5］。2007 年1月，Hu等［6］在恒河猴尺神经缺损处移植BMSCs，结果证实BMSCs移植与自体神经移植术后神经恢复效果相当，为BMSCs用来修复灵长类动物周围神经提供了有力的证据。2013年7月，Zhang等［7］将体外培养的BMSCs移植入大鼠坐骨神经15mm缺损模型，12周后电生理检测结果表明，再生神经的传导速度明显改善，改善了大鼠的行走行为，减轻了腓肠肌质量和复合肌肉动作电位（CMAP）波幅的降低，并发现大量的再生轴突。2015年，Zhu等［8］取成年大鼠的BMSCs进行体外培养、扩增并标记后移植入马尾神经损伤的大鼠中，术后12周显示，大鼠马尾神经得到修复并恢复一定功能。

FE是用于静脉给药的MRIT2加权造影剂，其外周为葡萄糖包裹，理化性质稳定［9］。注入人体后，其颗粒主要被正常肝脏组织内的网状内皮系统（库普弗细胞）所吞噬，造成肝脏组织的T2值明显缩短，使富含库普弗细胞的正常肝组织背景信号降低。有研究发现，利用转染试剂可以转运FE至细胞内［10-12］。本实验将超顺磁性氧化铁颗粒（SPIO）吞噬于BMSCs内并移植到兔坐骨神经缺损处，选择SE-T2WI序列进行MRI扫描。结果发现移植入兔坐骨神经内的FE标记BMCSs在移植初可发生局限性迁移，移植段周围可见低信号影。而后低信号影逐渐消失，被机体所吸收、代谢。由此证明FE标记的BMCSs与宿主坐骨神经及肌组织有很好的相容性，对周围结构无明显破坏。

本实验利用MRI成功活体观察了FE标记的干细胞在周围神经内的定位与迁移情况。但是因MRI分辨率有限及扫描厚度过大等缺点，一些组织切片结果及微小影像变化尚不能完全敏感地反映出来。相信随着MRI技术的进步，有望追踪到移植细胞更细微的影像变化。

综上所述，FE标记的兔骨髓基质源神经干细胞移植后，可在坐骨神经内存活、迁移、分化，利用MRI技术可以对移植后的标记细胞进行初步的活体追踪。

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本刊编辑部

Research on Feridex labeled bonemarrow stromal cellsautotransplant into rabbitsciatic nerve

He Xiao1，Deng Lili2，Zou Kang1
（1.First Department of Orthopedics，Central Hospital；2.Department of Pediatrics，North Branch Hospital，Chenzhou Municipal First People′s Hospital，Chenzhou，Hunan 423000，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.10.011

A

1009-5519（2016）10-1468-03

何骁（1982-），硕士研究生，主治医师，主要从事关节、创伤相关疾病的研究工作。

（2016-01-11）