妊娠期父源抗原特异性激活调节性T细胞的研究

屠海燕，寿张飞（.浙江大学医学院附属第二医院肾脏内科，浙江杭州3000；.浙江大学医学院附属第一医院肾脏内科，浙江杭州3000）

妊娠期父源抗原特异性激活调节性T细胞的研究

屠海燕1，寿张飞2
（1.浙江大学医学院附属第二医院肾脏内科，浙江杭州321000；2.浙江大学医学院附属第一医院肾脏内科，浙江杭州321000）

目的探讨妊娠诱导调节性T细胞扩增与父源抗原的关系。方法建立正常妊娠（n=15）、流产倾向（n= 15）、第三方交配（n=15）及假孕（n=6）共四组小鼠模型，观察调节性T细胞水平和激素含量变化。通过抗原特异性验证将父源抗原预免疫小鼠来源的调节性T细胞过继滴注到孕鼠体内，观察其对胚鼠的保护作用。结果流产倾向组与正常妊娠组孕鼠体内黄体酮、雌二醇、雌三醇水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。滴注父源抗原特异性激活调节性T细胞或经父源抗原预免疫的调节性T细胞后，孕鼠流产率下降，调节性T细胞水平升高。结论妊娠期调节性T细胞扩增发挥保护作用的是父源抗原特异性激活，并非单一激素含量变化引起。

T淋巴细胞，调节性；激素类；抗原；流产，自然

正常妊娠是一种成功的半同种异体移植现象，孕妇对胚胎半同种异体抗原不产生排斥反应，反而产生保护性免疫应答，这种现象叫母胎免疫耐受，其具体机制一直是该领域研究的热点。最近有研究表明，CD4+CD25+调节性T细胞不但参与了母胎免疫耐受机制的形成，而且对其维持具有重要作用［1］。2005年，Zenclussen等［2］提出，孕期调节性T细胞缺陷将导致免疫性的自然流产，所以调节性T细胞在正常妊娠中发挥了极其重要的作用。此外，已有研究证实，妊娠期间调节性T细胞会大量扩增，调节性T细胞是以抗原特异性方式扩增，并推测妊娠期激素水平变化是导致调节性T细胞扩增的直接因素［2-4］。基于以上问题，为了进一步明确妊娠期调节性T细胞的扩增原因，作者设计了该实验。现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物雌性CBA/J（H2K）小鼠51只、雄性DBA/2J（H2d）小鼠15只、雄性BALB/C（H2d）小鼠21只、雄性C57/BL6（H2b）小鼠15只均由浙江大学医学院实验动物中心提供。6～8周龄雌性小鼠和8～12周龄雄性鼠交配，每天检查孕栓情况，一旦发现孕栓立即将雌雄鼠分开，发现孕栓当天记录为孕0 d。

1.1.2试剂荧光素异硫氨酸标记的抗鼠CD4抗体、叶绿素蛋白标记的抗鼠CD3抗体、CY5标记的抗鼠CD8抗体、藻红蛋白标记的抗鼠CD25抗体和抗鼠IgG2a同型抗体均购自德国Becton Dickinson公司。藻红蛋白标记的抗鼠FOXP3抗体购自德国E-Bioscience公司。

1.2实验方法

1.2.1流式细胞仪方法采用小鼠淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，使用磷酸盐缓冲溶液（PBS）调整细胞浓度为1×107mL-1。取2只试管，各加入100 μL细胞悬液。每管中加入荧光标记抗鼠CD4抗体和抗CD25抗体各20 μL，然后4℃闭光孵育30 min。每个管中加入1 mL破膜缓冲液，于4℃闭光孵育30～60 min，使用2 mL的1×破膜缓冲液冲洗细胞，离心后弃上清液。一管中加入20 μL荧光标记抗鼠FOXP3抗体，另一管中加入20 μL抗鼠IgG2a同型对照，然后4℃闭光孵育30～60 min，离心去上清液后放入流式细胞仪进行检测。记录胚胎着床的时间点，另将出现坏死、出血的时间点记录为流产时间点，以流产点占所有着床点的百分比来计算流产率。酶联免疫吸附试验检测老鼠血清黄体酮、雌三醇、雌二醇水平。

1.2.2实验分组与设计

1.2.2.1实验分组（1）正常妊娠组：CBA/J小鼠与BALB/C交配各15只；（2）流产倾向组：CBA/J小鼠与DBA/2J小鼠交配各15只；（3）第三方组：CBA/J小鼠与C57/BL6小鼠交配各15只；（4）假孕组：CBA/J小鼠与输精管结扎的BALB/C小鼠交配各6只。结扎输精管的雄鼠精液不含有精子，但是含有父系抗原。

1.2.2.2实验设计（1）流产倾向组+静脉滴注2×105个正常妊娠组（CBA/J×BALB/C交配）孕14 d来源的调节性T细胞，n=6；（2）流产倾向组+静脉滴注2×105个第三方组（CBA/J×C57/BL6交配）孕14 d来源的调节性T细胞，n= 6；（3）流产倾向组+静脉滴注2×105个流产倾向组（CBA/J× DBA/2J交配）孕14d来源的调节性T细胞，n=6；（4）流产倾向组+静脉滴注2×105个下列方式取得的调节性T细胞：未交配过的CBA/J雌性小鼠先腹膜内注射1×107mL-1来自BALB/C雄性老鼠的脾脏细胞。上述处理后，雌鼠再和DBA/2J雄鼠交配。在孕14d，处死孕鼠，将分离得到的调节性T细胞用来静脉注射。

1.3统计学处理应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，采用秩和检验非参数分析法分析各组间的差异性，采用U检验和Dunn′s检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1流产倾向组、正常妊娠组孕鼠体内黄体酮、雌二醇、雌三醇水平比较流产倾向组CBA/J×DBA/2J交配后黄体酮含量孕3.0 d时明显上升，正常妊娠组CBA/J×BALB/C交配后孕3.0 d黄体酮水平升高。且在孕0.5、6.0、10.0d 3个时间点，流产倾向组、正常妊娠组孕鼠体内黄体酮水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图1。CBA/J× DBA/2J交配组、CBA/J×BALB/C交配组孕鼠在孕6.0 d时（孕6.0 d正好是流产发生时间）体内雌三醇、雌二醇水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见图2。但是CBA/J×DBA/2J交配后调节性T细胞数量并不扩增，见图3。

图1　流产倾向组、正常妊娠组孕鼠体内黄体酮水平各时间点变化

图2　流产倾向组、正常妊娠组孕鼠体内雌激素水平各时间点变化

图3　外周血调节性T细胞水平

2.2父系抗原特异性激活调节性T细胞扩增发挥保护性作用将来源于非孕雌鼠的调节性T细胞过继静脉滴注给流产倾向组雌鼠后，仍发生流产。正常妊娠组孕鼠（CBA/J×BALB/C-H2d交配）来源的调节性T细胞过继静脉滴注给流产倾向雌鼠后，流产率为1%，具有保护作用（图4）。第三方组合CBA/J×C57/BL6-H2b交配后CBA/J孕鼠产生的调节性T细胞过继静脉滴注给流产倾向组，结果显示，第三方组来源的调节性T细胞不保护带有H2K-H2d基因的胎鼠免受母鼠的排斥，流产率为13%（图4）。同样，过继静脉滴注CBA/J×DBA/2J-H2d交配组来源的调节性T细胞，不能保护CBA/J×DBA/2J-H2d组胚鼠免于流产，流产率为8%。

与此相反，若CBA/J雌鼠在交配前，用BALB/C品系的雄性老鼠脾细胞抗原预先注射免疫，其流产率明显下降，流产率为3%（图4）。同时，预先免疫注射父源脾脏细胞使孕鼠体内调节性T细胞数量增加（图3）。经过BALB/C品系雄性小鼠脾细胞抗原预先免疫静脉滴注后的CBA/J雌鼠，与带有H2d基因的DBA/2J小鼠交配后，此孕鼠来源的调节性T细胞过继静脉滴注给流产倾向组后，可保护胎儿免受排斥，达到正常怀孕，流产率为0（图4）。推测因为静脉滴注BALB/C脾细胞后产生了H2d特异性调节性T细胞。

为进一步证实调节性T细胞是父源抗原特异性激活的假说，观察到假孕组CBA/J小鼠与输精管结扎的BALB/C小鼠交配后体内调节性T细胞水平升高。外周血调节性T细胞水平和正常交配孕鼠体内调节性T细胞水平相当（正常妊娠组小鼠交配后的孕6.0 d），见图3。

图4　各组流产率散点图

3　讨　论

在正常妊娠中，胎儿的一半基因源于父亲，其编码的主要组织相容性抗原对母亲来说是一种同种异源基因抗原，理应认为被母体的免疫系统识别并加以排斥，但众所周知排斥反应在整个妊娠反应过程中并未发生。这必然存在母体免疫系统对胎儿的“半同种移植物”产生耐受，即母胎耐受。有研究证明，妊娠诱导调节性T细胞在母胎耐受中发挥重要作用［5-6］。尽管孕期调节性T细胞的数量扩增早有资料记载，Aluvihare等［3］研究发现，与未妊娠小鼠比较，无论是同种或异种交配的正常妊娠雌鼠，调节性T细胞几乎在所有免疫器官中均明显扩增。但是不能确定增加的调节性T细胞是因孕期体内激素水平的变化［7］，还是针对父源性抗原而存在，或是上述2种机制共同参与的结果。

本研究采用流产免疫学途径的最佳组合：雌性CBA/ J×雄性DBA/2J小鼠交配，原理是CBA/J品系的小鼠（带有H2K基因）和DBA/2J（带有H2d基因）的小鼠交配，流产率很高，而CBA/J品系的小鼠（带有H2K基因）与同样带有H2d基因的BALB/C小鼠交配时，并不会出现流产。

首先，将来源于非孕雌鼠调节性T细胞过继静脉滴注给有流产倾向的孕鼠后，仍发生流产，说明调节性T细胞未起保护作用。作者将正常妊娠孕鼠（CBA/J× BALB/C交配）来源的调节性T细胞过继静脉滴注给流产倾向孕鼠后，未发生流产，说明其对胎鼠起保护作用。本研究结果显示，调节性T细胞对胎鼠的保护作用与妊娠有关。

调节性T细胞的保护作用是否与妊娠中体内激素水平变化相关，对于激素水平的研究，实验设计正常孕鼠（CBA/J×BALB/C交配）和流产倾向小鼠（CBA/J×DBA/2J交配）分别在怀孕第0.5、3.0、6.0、10.0天处死，检测各个时间点激素水平。结果显示，自发性流产倾向小鼠和正常孕鼠一样，黄体酮均在孕3.0 d开始上升，但调节性T细胞的数量并没有扩增。同时孕鼠在孕6.0d（孕6.0d正好是CBA/J×DBA/2J交配后孕鼠流产发生时间）体内雌三醇和雌二醇水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。上述结果证实调节性T细胞扩增并不是由孕激素或雌激素水平的升高所引起。由此推测，调节性T细胞对胚鼠的保护作用与父系抗原特异性刺激相关。

正常妊娠孕鼠（CBA/J×BALB/C交配）来源的调节性T细胞过继静脉滴注给流产倾向雌鼠后，流产率为1%，具有保护作用。而转输第三方组（CBA/J×C57/BL6交配）孕鼠来源调节性T细胞不具有保护作用，流产率为13%。作者分析因为带有H2d基因的DBA/2J和带有H2d基因的BALB/C小鼠具有相同的主要组织相容性复合体（MHC）分子抗原，却不同于带有H2d基因的C57/BL6小鼠MHC分子抗原。正常孕鼠针对带有H2d基因的BALA/C老鼠抗原产生的调节性T细胞可以特异性地保护母体抗带有H2d基因的DBA/2J小鼠反应，而第三方组（CBA/J×C57/BL6-H2b）获得的调节性T细胞，不保护带有H2k×H2d基因的胎鼠。表明调节性T细胞具有保护性作用必须由父系MHC复合体抗原激活。这为抗原启动调节性T细胞功能提供了强有力的证据。

为进一步证明该假说，本实验观察了CBA/J品系雌鼠与输精管结扎的BALB/C老鼠交配，结扎输精管雄鼠的精液不含有精子，但含有父系抗原，该抗原确保了雌雄交配后雌鼠会针对该抗原进行细胞扩增。本研究观察到父系抗原在交配后第5天暴露，形成假孕。事实上，因为父源抗原驱使作用产生了调节性T细胞扩张池，观察到雌性鼠和输精管被结扎雄鼠交配后的外周血调节性T细胞水平明显升高，并且和正常交配的孕鼠体内调节性T细胞水平相当。

最后，作者观察到正常孕小鼠产后7 d，调节性T细胞数量恢复到未孕基础水平（图3），这意味着一旦抗原消失（孕鼠出生后），调节性T细胞在数量上即减少，保护作用同时消失，这也很好地解释了为什么在妊娠后母体会排斥来源于父源的移植物。

综上所述，妊娠期间调节性T细胞扩增不是激素事件驱动引起，而是针对父系抗原产生，这部分地解释了母胎耐受现象的相关机制，为今后相关研究提供了一定理论依据。

［1］Somerset DA，Zheng Y，Kilby MD，et al.Normal human pregnancy is associatedwith an elevation in the immune suppressive CD25+CD4+regulatory T-cell subset［J］.Immunology，2004，112（1）：38-43.

［2］Zenclussen AC，Gerlof K，Zenclussen ML，et al.Abnormal T-cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion：adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+T regulatory cellsprevents fetal rejection in a murine abortion model［J］.Am J Pathol，2005，166（3）：811-822.

［3］Aluvihare VR，Kallikourdis M，Betz AG.Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus［J］.Nat Immunol，2004，5（3）：266-271.

［4］Heikkinen J，Möttönen M，Alanen A，et al.Phenotypic characterization of regulatory T cells in the human decidua［J］.Clin Exp Immunol，2004，136 （2）：373-378.

［5］Saito S，Sasaki Y，Sakai M.CD4（+）CD25high regulatory T cells in human pregnancy［J］.J Reprod Immunol，2005，65（2）：111-120.

［6］ Sasaki Y，Sakai M，Miyazaki S，et al.Decidual and peripheral blood CD4+ CD25+regulatory T cells in early pregnancy subjects and spontaneous abortion cases［J］.Mol Hum Reprod，2004，10（5）：347-353.

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Study on role of paternal antigens-specific CD4+CD25+T regulatory cells during pregnancy

Tu Haiyan1，Shou Zhangfei2（1.Department of Nephrology，Second Affiliated Hospital，Medical College，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 321000，China；2.Department of Nephrology，First Affiliated Hospital，Medical College，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 321000，China）

ObjectiveTo investigate that the pregnancy induced T regulatory（Treg）cells are generated by aiming at paternal antigens or induced by in vivo hormone change.MethodsThe 4 mice model groups were set up：normal pregnancy（n=15），abortion trend（n=15），third party mating（n=15）and false pregnancy（n=6）.The change of Treg cells level and hormone content were observed.The Treg cells originated from paternal antigen premunity mice was adoptively instilled into the pregnant mice by the antigens-specific verification for observing its protective effect on embryonic mouse.ResultsThe in vivo progesterone，E2and E3levels had no statistical differences between the abortion trend group and the normal pregnancy group（P＞0.05）.After instilling Treg cells of paternal antigen specific activation or adoptive transfer paternal antigens-specific Treg cells，the abortion rate of pregnant mice was decreased，while Treg cells level was increased.ConclusionThe Treg cell amplification playing the protective role during pregnancy is paternal antigens specific activation，which is not caused by the single hormone content change.

T-lymphocytes，regulatory；Hormones；Antigens；Abortion，spontaneous

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.04.008

A

1009-5519（2016）04-0500-03

屠海燕（1985-），硕士研究生，主要从事肾脏疾病相关临床研究工作。

（2015-08-16

2015-09-24）