热休克蛋白60对急性胰腺炎发病的影响*

高志荣，李学晋（1.台州学院医学院，浙江台州18000；2.台州学院附属市立医院消化内科，浙江台州18000；.新乡医学院三全学院，河南新乡45000）

热休克蛋白60对急性胰腺炎发病的影响*

高志荣1，2，李学晋3
（1.台州学院医学院，浙江台州318000；2.台州学院附属市立医院消化内科，浙江台州318000；3.新乡医学院三全学院，河南新乡453000）

目的探讨热休克蛋白60（HSP60）对急性胰腺炎的影响。方法在急性胰腺炎模型复制成功后1、5、10 h，分别收集胰腺组织和血清，采用real time-PCR法测定胰腺组织中HSP60 mRNA的表达；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。结果在模型复制成功后1、5、10 h，胰腺组织HSP60 mRNA的表达水平呈明显下降趋势（P＜0.05），大鼠血清中TNF-α水平呈明显上升趋势（P＜0.05）。结论在急性胰腺炎的发生、发展过程中，胰腺组织HSP60表达逐渐下降，而胰腺组织的损伤程度逐渐加重，HSP60的低表达可能会增加急性胰腺炎的严重程度。

胰腺炎；急性病；热休克蛋白质类；肿瘤坏死因子α；胰腺

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是临床上危急重症较难治疗的疾病之一，且对其发病机制的研究有100多年历史，关于AP发病机制的假说包括胰腺自身消化学说、胰腺微循环障碍学说、胰腺腺泡细胞钙超载学说、氧自由基损伤学说、炎症介质-细胞因子损伤学说等，其中胰腺自身消化学说比较经典［1-3］。然而，胰腺腺泡细胞酶原激活与热休克蛋白60（heatshock protein 60，HSP60）的相互作用情况及对AP发病的影响尚未明确阐明［4-5］。本文作者就HSP60在AP发病中的作用进行研究。

1　材料与方法

1.1动物SD大鼠40只，体质量200～250 g，雌雄各半，购自复旦大学动物中心。

1.2方法

1.2.1AP模型复制实验前将SD大鼠于（25±2）℃、（55±5）%湿度环境下喂养，给予实验室标准食物和水。AP大鼠模型复制方法参照文献［6］，即受试SD大鼠于术前禁食、禁饮12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液（1 mL/kg）麻醉后，取上腹正中切口，暴露腹腔，在近肝门处用动脉夹夹闭胆总管，经胰胆管十二指肠开口处缓慢进针，以0.2 mL/min速度静脉注射3%去氧胆酸钠（1 mL/kg体质量），且注射后先压迫进针点，然后再解除胆管阻断，关闭腹腔。将40只大鼠随机分为两组，各20只，一组为假手术组（Sham组），另一组为AP模型组（AP组）。Sham组不给予去氧胆酸钠注射，其余操作方法与AP组相同。AP造模后1、5、10 h，在麻醉下分别取两组SD大鼠血液，离心取上清液，并各取其胰腺组织。

1.2.2real time-PCR法检测胰腺组织HSP60 mRNA表达胰腺组织HSP60 mRNA表达检测参照Li等［6］方法。采用Trizol试剂（TaKaRa公司）从胰腺组织块中提取总RNA并逆转录成cDNA，使用PCR仪（上海枫岭生物技术有限公司）进行基因扩增。PCR反应条件：95℃预变性10 s；95℃5 s，60℃31 s，45个循环。

1.2.3血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的检测采用定量酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（Sigma公司）进行检测，按照说明书介绍的方法操作，即在酶标板每孔中各加入标准品或待测样品100 μL，将反应板充分混匀后于37℃放置120min，用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干，每孔中加入一抗工作液100 μL，将反应板充分混匀后于37℃放置60 min，再次同上述洗板，每孔加酶标抗体工作液100 μL，将反应板于37℃放置30 min，第3次洗板，每孔加入底物工作液100 μL，于37℃暗处反应15 min，每孔加入100 μL终止液混匀，在30 min内用酶标仪测定450 nm处吸光度，所有光密度（OD）值均应减去空白OD值后再进行计算，以标准品2 000.0、1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、0.0pg/mL为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线，根据样品OD值在该曲线图上找出相应TNF-α含量，结果以“pg”为单位。

1.3统计学处理应用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1胰腺组织HSP60 mRNA表达量比较AP造模后1 h，胰腺组织HSP60 mRNA的相对表达量较高，在随后5、10 h时间点上，胰腺组织HSP60 mRNA的相对表达量呈下调趋势（P＜0.05）；在1 h时，与Sham组比较，HSP60 mRNA的相对表达量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；在5 h时，与Sham组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；在10 h时，AP组HSP60 mRNA的相对表达量较Sham组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　胰腺组织HSP60 mRNA的复制AP模型后相对表达量比较（±s，%）

表1　胰腺组织HSP60 mRNA的复制AP模型后相对表达量比较（±s，%）

注：与Sham组同时间点比较，aP＜0.05；与1 h AP组比较，bP＜0.05。

组别S h a m 组A P 组1 h 　5 h 　1 0 h 2 . 0 3 ± 0 . 3 7 4 . 3 5 ± 0 . 5 4a2 . 6 1 ± 0 . 4 8 2 . 8 2 ± 0 . 3 3b2 . 3 6 ± 0 . 4 2 1 . 3 2 ± 0 . 5 5ab

2.2AP大鼠血清中TNF-α的变化复制AP模型后1、5、10 h时间点上，大鼠血清中TNF-α呈明显升高趋势（P＜0.05）；在1 h时，与Sham组血清中TNF-α水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；但在5、10 h时，AP组血清中TNF-α的含量较Sham组均明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　大鼠血清中TNF-α表达情况比较（±s，pg/mL）

表2　大鼠血清中TNF-α表达情况比较（±s，pg/mL）

注：与Sham组同时间点比较，aP＜0.05；与1 h AP组比较，bP＜0.05。

组别S h a m 组A P 组1 h 　5 h 　1 0 h 8 6 . 0 0 ± 6 . 5 3 8 8 . 0 0 ± 5 . 7 2 9 9 . 0 0 ± 7 . 4 4 1 7 6 . 0 0 ± 6 . 9 0ab1 0 6 . 0 0 ± 7 . 8 2 2 0 2 . 0 0 ± 6 . 5 7ab

3　讨　论

AP发病机制较为复杂，有许多因素及环节参与其中，包括胰腺腺泡细胞内胰酶激活、缺血、钙超载、氧自由基、炎症介质-细胞因子等。AP的发生、发展一般分为3个阶段：触发阶段（启动阶段）、早期胰腺腺泡细胞事件阶段、晚期胰腺腺泡细胞和非胰腺腺泡细胞事件阶段。目前，多数学者认为AP的早期胰腺腺泡细胞事件是其发生、发展的关键环节，而早期胰腺腺泡细胞事件的关键是胰腺腺泡细胞内胰酶过早激活［7-8］。然而，胰腺腺泡细胞内胰酶过早激活的机制及早期胰腺腺泡细胞的可能事件还不十分清楚。

HSP60作为一种分子伴侣存在于所有原核及真核生物某些细胞器中，如线粒体。其重要的生物功能日益引起人们的重视，尤其是细胞保护作用。其在正常细胞中表达量极低，当细胞处于应激条件下（如休克、感染、高温、缺氧、创伤等）HSP60表达量明显升高，以提高细胞耐受应激的能力［9-14］。胰腺腺泡细胞内胰酶的分布特点与HSP60相似，从粗面内质网至酶原颗粒，最后胰酶释放。本研究结果显示，胰腺组织中HSP60 mRNA在AP模型后1 h表达水平明显增高，可认为在应激条件下胰腺腺泡细胞的反应，对胰腺腺泡细胞起到保护作用；然而HSP60 mRNA的表达量在AP模型后5、10 h持续显著下降，可能是胰腺组织受到较为严重的损伤导致胰腺组织活力下降，从而造成其合成减少。原因是作者可在AP模型后5、10 h观察到血清中TNF-α水平明显升高，而其在AP模型后1 h表达水平并未明显升高；然而，也有学者认为强刺激致HSP60表达水平减少也可能是AP发生的因素之一。由此，作者推测，胰腺组织HSP60表达水平升高可提高胰腺组织对损伤因子的保护作用，在AP发生、发展过程中，胰腺组织HSP60的表达水平减少可能与胰腺腺泡内胰酶过早激活有关，胰酶与HSP60二者失衡可能是促使AP发生、发展的机制之一，从而证实HSP60对胰腺腺泡细胞的保护作用，在临床上是否可以通过HSP60的高表达来减少胰腺组织的损伤，至于后续研究将进一步观察HSP60如何参与胰腺腺泡细胞内胰蛋白酶原的过早激活。

［1］Regenér S，Manjer J，Appelros S，et al.Protease activation，pancreatic leakage，and inflammation in acute pancreatitis differences between mild and severe cases and changes over the first three days［J］.Pancreatology，2008，8（6）：600-607.

［2］Van Acker GJ，Weiss E，Steer ML，et al.Cause-effect relationships between zymogen activation and other early events in secretagogue-induced acute pancreatitis［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2007，292 （6）：1738-1746.

［3］Matsukura A，Otani T，Takamoto T，et al.Intracellular activation of trypsinogen in rat pancreatic acini after supramaximal secretagogue stimulation：cysteine protease and serine protease activity［J］.Pancreas，2006，32（2）：197-204.

［4］Sherwood MW，Prior IA，Voronina SG，et al.Activation of trypsinogen in large endocytic vacuoles of pancreatic acinar cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（13）：5674-5679.

［5］Raraty MG，Murphy JA，Mcloughlin E，et al.Mechanisms of acinar cell injury in acute pancreatitis［J］.Scand J Surg，2005，94（2）：89-96.

［6］Li XL，Li K，Li YY，et al.Alteration of Cpn60 expression in pancreatic tissue of rats with acute pancreatitis［J］.Cell Stress Chaperones，2009，14（2）：199-206.

［7］ Frossard JL，Bhagat L，Lee HS，et al.Both thermal and non-thermal stress protect against caerulein induced pancreatitis and prevent trypsinogen activation in the pancreas［J］.Gut，2002，50（1）：78-83.

［8］Zhang H，Li YY，Wu XZ.Effect of tetrandrine on injury of pancreas and lung of rats with experimental acute pancreatitis［J］.Word J Gastroenterol，2006，12（26）：4232-4236.

［9］ Bose SM，Verma GR，Mazumdar A.Significance of serum endotoxin and antiendotoxin antibody levels in predicting the severity of acute pancreatitis［J］.Surg Today，2002，32（7）：602-607.

［10］Guija de Arespacochaga A，Hittmair KM，Schwendenwein I.Comparison of lipase activity in peritoneal fluid of dogs with different pathologies—a complementary diagnostic tool in acute pancreatitis？［J］.J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med，2006，53（3）：119-122.

［11］Ramudo L，Manso MA，Dedio I.Biliary pancreatitis-associated ascitic fluid activates the production of tumor necrosis factor-alpha in acinar cells［J］. Crit Care Med，2005，33（1）：143-148.

［12］Li YY，Lu XY，Li XJ，et al.Intervention of pyrrolidine dithiocarbamate and tetrandrine on cellular calcium overload of pancreatic acinar cells induced by serum and ascitic fluid from rats with acute pancreatitis［J］.J Gastroenterol Hepatol，2009，24（1）：155-165.

［13］Li YY，Gingras D，Londono I，et al.Expression differences in mitochondrial and secretory chaperonin 60（Cpn60）in pancreatic acinal cells［J］. Cell Stress Chaperones，2003，8（3）：287-294.

［14］Bhagat L，Frossard JL，Hietaranta A.Water immersion stress induces heat shock protein 60 expression and protects against pancreatitis in rats［J］. Gastroenterology，2000，119（1）：220-229.

Influence of heat shock protein 60 on onset of acute pancreatitis*

Gao Zhirong1，2，Li Xuejin3（School of Medicine，Taizhou College，Taizhou，Zhejiang 318000，China；2.Department of Gastroenterology，Affiliated Municipal Hospital，Taizhou College，Taizhou，Zhejiang 318000，China，China；3.Sanquan College，Xinxiang Medical College，Xinxiang，Henan 453000，China）

ObjectiveTo explore the influence of heat shock protein 60（HSP60）on acute pancreatitis（AP）.Methods The pancreatic tissue and serum were collected at 1，5，10 h after successfully copying AP model，respectively.The real time PCR was adopted to detect the expression of HSP60 in pancreatic tissue；the ELISA method was used to detect the level of serum TNF-α.ResultsThe expression of pancreatic tissue HSP60 mRNA at 1，5，10 h after successfully copying AP model showed the obvious downward trend（P＜0.05），the serum TNF-α level in rat demonstrated significantly increasing trend（P＜0.05）.ConclusionIn the process of the occurrence and progression of AP，the expression of pancreatic tissue HSP60 expression is gradually declined，and the injury degree of pancreatic tissue is much more severer，low expression of HSP60 may increase the severity of acute pancreatitis.

Pancreatitis；Acute disease；Heat-shock proteins；Tumor necrosis factor-alpha；Pancreas

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.04.003

A

1009-5519（2016）04-0487-02

浙江省台州市科技局资助项目（2011ky1101）。

高志荣（1978-），博士研究生，讲师，主要从事消化系统疾病的研究。

（2015-11-20）