代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

李燕军，张海宾，麻杰，张成林，谢希贤，陈宁

（1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津300457；3.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津300457）

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

李燕军1，2，3，张海宾1，麻杰1，张成林1，2，3，谢希贤1，2，3，陈宁1，2，3

（1.天津科技大学生物工程学院，天津300457；2.代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津300457；3.天津市氨基酸高效绿色制造工程实验室，天津300457）

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株，利用基因重组技术替换ilvLXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH，以期获得L-异亮氨酸生产菌。将ilvLXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilvLXGM后获得ILE01菌株，于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvIH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH，获得菌株ILE02和ILE03，其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19 g/ L。针对ILE03α-酮丁酸积累量过高的问题，通过改变操纵子中ilvA和ilvIH的顺序调节其转录水平，获得菌株ILE04，其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L。利用ILE04于5 L发酵罐中进行发酵实验，L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/（L·h）及4.6%。

L-异亮氨酸；大肠杆菌；反馈抑制；苏氨酸脱水酶；乙酰羟基酸合成酶

L-异亮氨酸是人和脊椎动物的八种必需氨基酸之一，在生命活动中具有极其重要的作用，被广泛应用于食品、医药等诸多领域。目前主要采用谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）发酵法工业化生产L-异亮氨酸，然而该类菌株发酵周期较长［1］。大肠杆菌具有遗传背景清晰、技术操作简单、代时短等优势，因而被广泛应用于L-苏氨酸、L-色氨酸及L-苯丙氨酸等氨基酸的生产［2］。

图1　L-异亮氨酸代谢调控机制

大肠杆菌L-异亮氨酸合成途径及调控机制如图1所示，L-苏氨酸经5步反应后生成L-异亮氨酸，其中ilvA编码的苏氨酸脱水酶和ilvIH编码的乙酰羟基酸合成酶为关键酶（共3个同工酶，分别由ilvBN、ilvGM及ilvIH编码）受L-异亮氨酸的反馈阻遏和反馈抑制作用［3］。Guillouet等［4］于野生型大肠杆菌和谷棒杆菌中过表达ilvA，使L-异亮氨酸的产量分别提高50倍和4倍，合成L-赖氨酸的代谢流70%流向L-异亮氨酸合成途径。Holátko等［5］发现降低ilvA转录量可减少L-异亮氨酸产量。Yin等［6］在L-异亮氨酸生产菌C.glutamicum JH13-156中串联过表达解除反馈抑制的ilvA和ilvBN，使得L-异亮氨酸产量提高131.7%。

课题组保藏的L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD于5 L发酵罐中发酵28 h可产L-苏氨酸130 g/L以上，因此该菌株经代谢工程改造具有合成L-异亮氨酸的潜力［7］。本文采用基因重组技术将THRD ilvLXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilvLXGM，在此基础上通过过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH，以期获得L-异亮氨酸生产菌株。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株、质粒及引物

本文所用菌株、质粒及引物分别见表1、表2和表3。

表1　菌株

表2　质粒

接上表

表3　引物

1.1.2培养基

LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，NaCl 5 g/L，固体培养基需添加琼脂条20 g/ L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。

斜面培养基：蔗糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 2.5 g/L，琼脂条20 g/ L，pH 7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。

种子培养基：葡萄糖25 g/L，酵母粉10 g/L，胰蛋白胨6 g/L，（NH4）2SO42 g/L，KH2PO41.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4· H2O 10 mg/L，维生素B族（VB1、VB3、VB5、VB7、VB12）溶液1mg/L，pH 7.0～7.2，115℃灭菌15min。

发酵培养基：葡萄糖30 g/L，酵母粉2 g/L，柠檬酸钠1 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，FeSO4·7H2O 50 mg/L，MnSO4·H2O 50 mg/L，B族维生素（VB1、VB3、VB5、VB7、VB12）0.8mg/L，玉米浆20 mL/L，pH 7.0～7.2，115℃灭菌20min。

1.2方法

1.2.1菌株ILE01构建

根据Genbank中E.coli MG1655的ilvLXGMEDA序列，采用Primer Premier 5设计用于扩增该操纵子启动子替换片段的引物（表3）。分别利用ilv-1和ilv-2、ilv-3和ilv-4、ilv-5和ilv-6、ilv-7和ilv-8扩增启动子上游同源臂、质粒pKD3中氯霉素抗性基因盒、启动子Ptrc以及下游同源臂。将启动子上游同源臂与氯霉素抗性基因盒扩增产物以等摩尔比混合作为重叠PCR模板，利用引物ilv-1和ilv-4扩增获得二者重叠片段，同理获得启动子Ptrc与下游同源臂重叠片段。采用相同方法，利用引物ilv-1和ilv-8获得上游同源臂、氯霉素抗性基因盒、启动子Ptrc以及下游同源臂重叠片段ilvPtrc。构建过程如图2所示。

图2　ilvLXGMEDA操纵子启动子替换片段ilvPtrc的构建示意图

将纯化后的ilvPtrc片段电转化至含有pKD46的E.coli THRD的感受态细胞，于LB液体培养基中37℃、200 r/min振荡培养1 h后，全部涂布至含氯霉素（30μg/mL）的LB固体培养基上，37℃倒置培养。待菌落长出后，挑取单菌落利用引物ilv-1和ilv-8进行PCR。将质粒pCP20转化至验证为阳性的转化子感受态中，经复苏后涂布至含氨苄青霉素（50μg/mL）的LB固体培养基上并于37℃倒置培养。待菌落长出后，挑取单菌落利用引物ilv-1和ilv-8进行PCR。将阳性转化子于LB液体培养基中，42℃、200 r/min振荡培养过夜后，在LB固体培养基上划线。挑取单菌落分别接种于LB固体培养基或含氨苄青霉素（50 μg/mL）的LB固体培养基上，选择在前者生长而后者不生长的菌落，再次进行PCR验证，将验证正确的菌株命名为ILE01。构建过程如图3所示。

图3　ILE01构建示意图

1.2.2重组质粒pWSK-IH、pWSK-AIH和pWSK

IHA及菌株ILE02、ILE03和ILE04的构建

根据Genbank中E.coli MG1655苏氨酸脱水酶编码基因ilvA和乙酰羟基酸合成酶III编码基因ilvIH的序列，用软件Primer Premier 5设计引物，其中引物ilvA-2（1 339thC→T，1 341stG→T，1 351stC→G，1 352ndT→C）、ilvA-3（1 339thG→A，1 341stC→A，1 351stG→C，1 352ndA→G）、ilvIH-2（1 768thG→A，1 777thC→T）及ilvIH-3 （1 768thC→T，1 777thG→A）含突变位点［8］。以THRD基因组为模板，分别利用ilvIH-1和ilvIH-2 及ilvIH-3和ilvIH-4扩增ilvIH基因上下游片段，将二者以等摩尔比混合作为重叠PCR模板，利用引物ilvIH-1和ilvIH-4扩增并回收后经Pst I和Xho I双酶切连接至经相同酶切的pWSK29质粒，获得重组质粒pWSK-IH。

以THRD基因组为模板，分别利用ilvA-1和ilvA-2及ilvA-3和ilvA-4扩增ilvA基因上下游片段，将二者以等摩尔比混合作为重叠PCR模板，利用引物ilvA-1和ilvA-4扩增并回收后经Xba I和BamH I双酶切连接至经相同酶切的pWSK-IH质粒，获得重组质粒pWSK-AIH。分别利用引物ilvIH-5和ilvIH-6及ilvA-5和ilvA-6扩增获得ilvIH和ilvA，经回收、酶切后依次连接至pWSK29，获得重组质粒pWSK-IHA。分别将pWSK-IH、pWSK-AIH和pWSK-IHA电转化至ILE01，获得ILE02、ILE03及ILE04。

1.2.3实时定量RT-PCR

根据ilvA、ilvD和ilvE及E.coli MG1655 16S rDNA（rrnb，内参）基因序列，采用Primer 5.0软件设计用于实时定量RT-PCR引物（表3）。利用Trizol提取菌体总RNA并用primeScriptTMRT试剂盒将其反转录成cDNA。采用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ荧光定量RT-PCR试剂盒及Realtime PCR仪测定基因转录水平（反应程序为第一步：95℃预变性30 s，1个循环；第二步：95℃变性5 s，60℃退火和延伸共34 s，40个循环）。采用ΔΔCT相对定量法计算被试基因的转录量［9］。

1.2.4发酵条件

摇瓶发酵：将ILE01、ILE02、ILE03和ILE04菌株经斜面活化后接种至含30 mL种子培养基的500 mL摇瓶中，32℃、200 r/min振荡培养至OD600为4～6时，以10%（体积分数）接种量接种至含30 mL发酵培养基的500 mL摇瓶中，32℃、200 r/min振荡培养。用氨水调节pH维持在6.7～7.0。发酵周期为28 h，期间补加浓度为60%的葡萄糖。

5 L发酵罐发酵：将LE04接种于斜面培养基上，并于37℃下培养14～18 h，取适量无菌去离子水清洗斜面制备成菌悬液，然后全部接种至装有1.5 L种子培养基的5 L发酵罐中。培养温度36℃，自动流加氨水控制pH约7.0，培养至OD600为12～14 h时，按13%（体积比）比例保留种子培养物并加入发酵培养基。发酵过程中培养温度控制在37℃，控制pH约7.0，溶氧控制在30%～40%，当培养基中葡萄糖耗尽时，以一定脉冲速度流加800 g/L葡萄糖溶液。菌体OD600为20时，添加终浓度0.1mmol/L的IPTG。

第六，封桩。截桩完成后，在保持千斤顶荷载稳定不变的情况下将桩、梁预留钢筋采用钢套筒接驳器进行连接，浇筑微膨胀混凝土封桩。

1.2.5分析方法

菌体生物量以菌体干重计，根据公式（菌体干重=0.37×OD600）计算菌体生物量。

葡萄糖浓度采用SBA-40C生物传感仪测定。

采用高效液相色谱仪测定氨基酸及α-酮基丁酸浓度，氨基酸检测条件为：Agilent C18（150 mm×4.6mm，5μm），采用乙腈和磷酸二氢钾溶液梯度洗脱，柱温39℃，流动相流速1 mL/min，检测波长276 nm；α-酮基丁酸检测条件为：Aminex HPX-87H column（300 mm×7.8 mm，5 μm），流动相5mmol/LH2SO4，流速0.5mL/min，柱温30℃，检测波长215 nm。

2　结果与讨论

2.1ilvLXGMEDA启动子替换对菌株ILE01

ilvEDA转录水平及其L-苏氨酸代谢的影响

在大肠杆菌THRD基因组中，ilvLXGMEDA为一个操纵子，其中ilvL为弱化子，对下游基因具有弱化作用。此外，ilvGM基因中ilvG基因发生碱基缺失突变，导致ilvGM基因编码的乙酰羟基酸合成酶无活性［8，10］。因此，替换ilvLXGMEDA操纵子启动子时，同时将ilvLXGM敲除，以期达到强化ilvEDA基因转录的目的。

M：Mark；1：上游同源臂；2：氯霉素抗性片段；3：trc启动子；4：下游同源臂；5：上游同源臂和氯霉素抗性基因盒重叠片段；6：trc启动子和下游同源臂重叠片段；7：启动子替换四段重叠片段；8：以出发菌株基因组为模板；9：以第一次重组菌株基因组为模板；10：以菌株ILE01基因组为模板

将ilvPtrc电转化至含pKD46质粒的E.coli THRD，经筛选后挑取单菌落利用引物ilv-1和ilv-8进行PCR验证，扩增产物大小为2 109 bp（即第一次重组菌株，出发菌株产物大小为3 000 bp，图4），表明ilvPtrc成功整合至基因组中。将pCP20质粒电转化到上述菌株中，经筛选后挑取单菌落利用引物ilv-1和ilv-8进行PCR验证，扩增产物分子量为1 179 bp，表明启动子替换成功同时ilvLXGM被敲除。

为了验证启动子的替换对其调控基因转录的影响，分别测定出发菌株THRD和ILE01 ilvA、ilvD及ilvE的转录水平，结果表明ILE01上述3基因的转录水平分别较出发菌株提高10.2倍、15.9倍和8.1倍，说明Ptrc启动子的替换有助于上述基因转录水平的提高。

对ILE01进行摇瓶发酵实验，考察替换ilvLXGMEDA启动子对其产酸特性的影响，以转化有pWSK29的THRD为对照。结果如表4所示：ILE01的L-苏氨酸积累量显著降低（由25.7 g/L降低至21.5 g/L），α-酮丁酸积累1.21 g/L，但未检测到L-异亮氨酸生成。表明增强ilvEDA转录水平可使L-苏氨酸代谢为α-酮丁酸，但可能由于乙酰羟基酸合成酶水平不足导致其难以进一步代谢。

2.2过表达ilvIH对异亮氨酸产量的影响

大肠杆菌共有3个乙酰羟基酸合成酶，分别由ilvBN、ilvGM及ilvIH编码，如前所属ilvGM因碱基缺失突变而无活性，ilvIH对α-酮丁酸的亲和力优于ilvBN，故选择ilvIH进行过表达。

利用重叠PCR手段扩增获得ilvIH突变体，经测序发现获得的突变体与预期一致（1 768thG→A，1 777thC→T），即获得解除反馈抑制的ilvIH。将其连接至pWSK29，经Pst I及Pst I和Xho I酶切后，分别获得大小约为7 000、5 000及2 000 bp的条带，与预期一致（分别为7 653、5 453和2 219 bp，图5），表明ilvIH成功连接至pWSK29，将其命名为pWSK-IH。

将pWSK-IH转化至ILE01后，经筛选、菌落PCR验证后获得ILE02，对其进行摇瓶发酵实验，考察过表达解除反馈抑制的ilvIH对L-异亮氨酸产量的影响，以转化有pWSK29的THRD为对照。结果如表4所示：ILE02 L-苏氨酸的积累量显著降低（由21.5 g/L降低至10.7 g/L），L-异亮氨酸的产量为1.75 g/L，α-酮丁酸积累量亦显著降低（0.49 g/L）。

2.3共表达ilvA和ilvIH对异亮氨酸产量的影响

在大肠杆菌中ilvA表达产物苏氨酸脱水酶受L-异亮氨酸的反馈抑制作用，而THRD的ilvA未发生突变，即该菌株苏氨酸脱水酶受L-异亮氨酸的反馈抑制作用未被解除，因此于ILE01中共过表达解除反馈抑制的ilvA和ilvIH考察其对异亮氨酸产量的影响。

利用重叠PCR手段扩增获得ilvA突变体，经测序发现获得的突变体序列与预期一致（1 339thC→T，1 341stG→T，1 351stC→G，1 352ndT→C），即获得解除反馈抑制的ilvA。将其连接至pWSK-IH，经Xba I及Xba I和BamH I酶切后，分别获得大小约为9 000、7 000及1 500 bp的条带，与预期一致（分别为9 198、7 653和1 545 bp，图5），表明ilvA成功连接至pWSK-IH，即获得含人工操纵子ilvAIH的重组质粒，将其命名为pWSK-AIH。

将pWSK-IH转化至ILE01后，经筛选、菌落PCR验证后获得ILE03，对其进行摇瓶发酵实验。结果如表4所示：ILE03的L-苏氨酸积累量大幅度降低（0.29 g/L），L-异亮氨酸的产量为2.19 g/ L，较ILE02提高25%。然而α-酮丁酸积累量却有所升高（1.47 g/L），暗示α-酮丁酸进一步代谢的流量不足致使其积累，其原因可能是ilvA的表达强度高于ilvIH。

因此，改变人工操纵子中ilvA和ilvIH的顺序，即将ilvIH置于ilvA上游，获得重组质粒pWSK-IHA，将其转化至ILE01后，经筛选、菌落PCR验证后获得ILE04并进行摇瓶发酵实验。结果如表4所示：ILE04的L-异亮氨酸的产量为2.85 g/L，较ILE02提高30.1%，且α-酮丁酸积累量降低至0.48 g/L。

图5　质粒pWSK-IH和pWSK-AIH酶切验证图谱

表4　不同菌株L-苏氨酸、α-酮丁酸及L-异亮氨酸合成量

2.4菌株ILE04发酵罐发酵实验

将菌株ILE04于5 L发酵罐中进行发酵实验，考察其产酸特性。结果如图6所示：菌株于14 h时生物量最高，达21.01 g/L（细胞干重），随后进入稳定期，22 h后生物量降低；L-异亮氨酸于4 h时开始合成，10 h后合成速率升高，16 h后合成速率下降，发酵结束时其浓度达5.23 g/L，单位菌体产量和发酵强度分别为0.25 g/g（细胞干重）和0.17 g/（L·h），转化率为4.6%。

图6　菌株ILE04发酵过程曲线

表5　菌株ILE04主要发酵参数

3　结论

本文以L-苏氨酸生产菌THRD为研究对象，采用代谢工程原理和技术，通过替换ilvLXGMEDA启动子、过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH，实现L-苏氨酸代谢途径的延伸，获得能够过量积累L-异亮氨酸的菌株ILE04。该菌株于5 L发酵罐中L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/（L·h）及4.6%。本文可为L-异亮氨酸生产菌的代谢工程改造提供参考。

［1］MORBACH S，SAHM H，EGGELING L.L-isoleucine production with Corynebacterium glutamicum：Further flux increase and limitation of export［J］.Applied and environmentalmicrobiology，1996，62（12）：4345-4351.

［2］PARK JH，JANGY S，LEE JW，etal.Escherichia coli wasanew platform strain for theenhanced production of L-valineby systems metabolic engineering［J］.Biotechnology and bioengineering，2011，108（5）：1140-1147.

［3］PARK JH，LEE SY.Fermentative production of branched chain amino acids：a focus on metabolic engineering［J］.Applied microbiology and biotechnology，2010，85（3）：491-506.

［4］GUILLOUET S，RODAL A A，AN G H，et al.Expression of the Escherichia coli catabolic threonine dehydratase in Corynebacterium glutamicum and its effect on isoleucine production［J］.Applied and environmentmicrobiology，1999，65 （7）：3100-3107.

［5］HOLATKO J，ELISAKOVA V，PROUZA M，et al.Metabolic engineering of the L-valine biosynthesis pathway in Corynebacterium glutamicum using promoter activity modulation ［J］.Journal of biotechnology，2009，139（3）：203-210.

［6］YIN Lianghong，HU Xiaoqing，XU Daqing，et al.Co-expression of feedback-resistant threonine dehydratase and acetohydroxy acidsynthaseincreaseL-isoleucineproduction in Corynebacterium glutamicum［J］.Metabolic engineering，2012，14（5）：542-550.

［7］XIE Xixian，LIANG Yuan，LIU Hongliang，et al.Modification of glycolysis and its effecton production of threonine in Escherichia coli［J］.Journal of industrial microbiology and biotechnology，2014，41（6）：1007-1015.

［8］PARK J H，OH J E，LEE K H，et al.Rational design of Escherichia coli for L-isoleucine production.［J］.Acs synthetic biology，2012，1（11）：532-540.

［9］LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［10］HASHIGUCHIK，TAKESADA H，SUZUKIE，etal.Construction of an L-isoleucine overproducing strain of Escherichia coli K-12［J］.Bioscience biotechnology and biochemistry，1999，63（4）：672-679.

（责任编辑：朱小惠）

Study on metabolic engineering of Escherichia coli for L-isoleucine production

LIYanjun1，2，3，ZHANG Haibin1，MA Jie1，ZHANG Chenglin1，2，3，XIE Xixian1，2，3，CHEN Ning1，2，3
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.National and Local United Engineering Lab ofMetabolic Control Fermentation Technology，Tianjin 300457，China；3.Tianjin Engineering Lab of Efficientand Green Amino Acid Manufacture，Tianjin 300457，China）

L-threonine-producing strain Escherichia coli THRD was used as starting strain to construct an L-isoleucine producing strain via metabolic engineering.Native promoter of ilvLXGMEDA was replaced with strong promoter Ptrc，resulting in ILE01.In order to relieve feedback inhibition，overexpression of ilvIH and ilvA together with ilvIH in ILE01 resulted in ILE02 and ILE03，of which L-isoleucine production was 1.75 g/L and 2.19 g/L，respectively.To reduceα-keto butyric acid accumulation in ILE03，ilvA and ilvIH transcription level was regulated via the change of the genes position in the artificial operon to obtain ILE04 and the L-isoleucine production of ILE04 was 2.85 g/L.Fermentation was performed in 5-L fermentator with ILE04，in which L-isoleucine production，productivity and conversion were 5.23 g/L，0.17 g/（L·h）and 4.6%，respectively.

L-isoleucine；Escherichia coli；feedback inhibition；threonine dehydratase；acetohydroxy acid synthase

TQ922

A

1674-2214（2016）03-0133-07

2016-05-13

国家自然科学基金资助项目（31300069）；天津市大学生创新创业训练计划项目（201510057063）；天津市科技特派员项目（15JCTPJC62800）

李燕军（1983—），男，山西吕梁人，讲师，博士，研究方向为谷氨酸棒杆菌利用木质纤维素水解液发酵生产氨基酸及其衍生物，E-mail：yili@tust.edu.cn.