生物催化法水解制备N-BOC-L-α-氨基丁酸

王宇光，叶秋娟，吴冬梅，魏春

（浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014）

研究报告

生物催化法水解制备N-BOC-L-α-氨基丁酸

王宇光，叶秋娟，吴冬梅，魏春

（浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014）

利用实验室筛选得到的高立体选择性脂肪酶产生菌株溜曲霉（Aspergillus tamarii WYC3）不对称水解拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯得到N-BOC-L-α-氨基丁酸，对其反应条件进行研究，确定其最优反应条件为：0.1mol/L pH 7.2的磷酸钾缓冲液，反应温度30℃，底物浓度52.24 mmol/L，0.1 g菌粉，V（底物）∶V（丙酮）=1∶8，200 r/min恒温水浴反应6 h，可获得产物N-BOC-L-α-氨基丁酸，此时e.e.s值达到99.95%，对映体选择率E值为20.11，产率为36.21%。

N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯；N-BOC-α-氨基丁酸；Aspergillus tamarii WYC3；水解反应；工艺优化

N-BOC-DL-α-氨基丁酸酯是一种重要的生化试剂，用于合成多肽或模拟肽和保护氨基酸单体。N-BOC-DL-α-氨基丁酸酯可以通过化学水解获得L-α-氨基丁酸。L-α-氨基丁酸不仅可以参与人体内信息传递，对代谢具有积极的影响，还是重要的医药与化工原料的中间体。现今L-α-氨基丁酸在化工与医药业中的作用日趋增大，其需求量也在逐渐增多，以每年15%甚至更高的速率增长［1］。由于L-α-氨基丁酸属于非天然氨基酸，无法自然获得，因此L-α-氨基丁酸的制备已成为研究热点。

目前，文献报道的制备L-α-氨基丁酸的主要方法包括化学法和生物法。化学法分化学合成法（有脱硫反应法［2-6］、α-卤代酸的氨解法［7-8］、丁酮酸还原法（外消旋）［9］和氨化水解反应法［10］）和化学拆分法［11］。生物法分为生物酶法和生物发酵法，生物酶法催化制备手性氨基酸避免了化学合成法存在的大部分缺点，具有立体选择性高、反应条件温和、生产成本低、污染少等优点，慢慢取代一些化学法成为新的发展方向。生物酶法中尚无利用脂肪酶催化制备手性L-α-氨基丁酸的研究报道，但有通过其他酶法（氨基转移酶催化法［12］、氨基酰化酶拆分法［13］和氧化还原酶催化法［14］）来制备手性L-α-氨基丁酸的相关报道，可是其催化效果都不甚理想，一般需要两步或两步以上的催化反应过程，有些还需要添加昂贵的催化剂或辅酶，不能满足大规模生产的需要。与之相比，脂肪酶（EC 3.1.1.3）作为一类能够催化三酰甘油酯水解成甘油、甘油单酯、甘油二酯和脂肪酸的反应条件温和、环境友好的生物催化剂［15］，具有多种催化能力，可以催化多种酯类化合物的酯化、转酯化、醇解、水解以及酯类化合物的逆向合成反应，且反应过程快速，操作简便，因此在催化合成新型化合物中逐渐变得更有优势［16］。

本文以N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯为底物，在Aspergillus tamarii WYC3菌体作用下进行脂肪酶不对称水解拆分反应，并通过对其反应条件的优化，得到光学纯N-BOC-L-α-氨基丁酸。NBOC-L-α-氨基丁酸之后用盐酸处理脱BOC基团后即可得到L-α-氨基丁酸。反应过程见图1。

1　材料和方法

1.1菌株

实验室内低温保藏的高立体选择性脂肪酶产生菌株Aspergillus tamarii WYC3。

1.2主要试剂

实验室所需的N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯购买自阿拉丁试剂有限公司，乙酸乙酯、丙酮等本实验使用的试剂均为市售的分析纯。

1.3培养基

发酵培养基：氯化钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，磷酸氢二钾1 g，蔗糖20 g，硝酸钠3 g，硫酸亚铁0.01 g，水1 000mL，pH 7.0。121℃灭菌20min。

斜面培养基：PDA培养基，新鲜去皮后的土豆200 g，切成小块，水中煮沸约半小时，纱布过滤，滤液加入20 g蔗糖，20 g琼脂，补足水至1 000mL。121℃灭菌20min。

1.4菌粉制备

以1%的接种量将菌悬液接种到50 mL的发酵培养基中。然后在恒温摇床中30℃、200 r/min培养2 d。培养结束后，用纱布过滤发酵液获得菌体，然后用0.1 mol/L磷酸钾缓冲溶液（pH 7.0）冲洗数次，将其悬浮于同样的磷酸钾缓冲溶液中。使用真空冷冻干燥机真空冷冻干燥得到Aspergillus tamari WYC3的冻干菌粉。

1.5实验方法

1.5.1气相色谱分析方法

采取GC-2010气相色谱仪来检验N-BOCDL-α-氨基丁酸甲酯及其产物N-BOC-L-α-氨基丁酸。所选用的手性气相色谱柱型号为BGB-175。载气气体：N2（70 kPa）；空气流：300mL/min；尾吹气流量：30 mL/min；进样量：1μL；进样口温度：220℃；分流比50∶1；柱箱：初始温度120℃保持2min后，以4℃/min的速度升温至195℃，保持2 min；色谱柱恒定流量：1 mL/min；检测器：FID，温度为250℃。N-BOC-D-α-氨基丁酸甲酯和N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯分别在11.238min 和11.375 min出峰，水解产物BOC-D-α-氨基丁酸和BOC-L-α-氨基丁酸分别在20.712 min和20.946min出峰。

底物的对映体过量值简称e.e.s、产物的对映体过量值简称e.e.P、反应转化率C和产率由气相色谱仪测定出的各物质的峰面积计算［17］，对映体选择性E值根据以下公式进行计算。

1.5.2N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯水解反应条件单因素实验

基本的反应体系为菌体添加量为0.02 g/mL，加入5mL含有50μL底物N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯，pH 7.0的0.1 mol/L磷酸钾缓冲溶液，放入30℃的恒温水浴摇床中，搅拌转速为200 r/ min，反应6 h。在此基础上，控制变量，依次设置不同的单因素，pH值分别为6.0、6.4、6.8、7.0、7.2、7.6、8.0的磷酸钾缓冲液（0.1 mol/L）；恒温水浴温度设置为15、20、25、30、35、40、45和50℃；底物N-BOC-α-氨基丁酸甲酯的浓度为26.12、52.24、78.36、104.48、130.60、156.72、182.85、208.97 mmol/L，通过实验确定最佳水解条件，每组单因素实验进行平行实验3次。

2　结果与讨论

在无催化剂的情况下，底物N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的自发水解率非常低（8 h内小于6%），几乎可以忽略不计。因此，实验操作时为减小误差，一般将转化时间控制在8 h以内。

2.1缓冲溶液pH对酶催化反应的影响

缓冲液的种类和pH对水解制备N-BOC-L-α-氨基丁酸具有一定的影响，因为它能影响到水解酶的空间结构，进而改变底物的解离状态，最后影响到酶活性中心和底物的结合效果。

缓冲溶液pH的平行对照组实验结果如图2所示：在缓冲液体系中，随着pH的逐渐增大，底物N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的e.e.s值、对映体选择率E值和水解产率也逐渐增大；在pH 7.2略偏碱性的缓冲体系环境下，达到最大值；pH继续升高，图中的底物N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的e.e.s值、对映体选择率E值和水解产率都有所下降。所以选择pH 7.2的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液为酶催化反应的最优条件。在此条件下，底物e. e.s大于99%，E值为20.34，产物N-BOC-L-α-氨基丁酸的产率为36.31%。

2.2温度对酶催化反应的影响

通过温度的平行对照组实验，可得到图3。从图中可得：随着温度的逐渐升高，底物N-BOCDL-α-氨基丁酸甲酯的e.e.s值、对映体选择率E值和水解产率也逐渐增大，在温度达到30℃时达到最大值；温度继续升高，图中的对映体选择率E值和水解产率都从缓慢下降变为急剧下降。

因为温度升高使底物分子的热运动加快，酶活性增强，从而酶促反应速率也加快。而温度继续升高，出现水解产率先缓慢降低然后快速下降的状况，这是因为温度的逐渐升高使得酶变性，逐渐失去酶活力，使得酶促反应速率大大降低甚至停止。从绿色经济高效的角度考虑，此催化反应的最优温度为30℃。在此条件下，底物e.e.s大于99%，E值为19.78，产物N-BOC-L-α-氨基丁酸的产率为35.96%。

2.3底物浓度对酶催化反应的影响

确定菌粉质量0.1 g不变，通过改变底物浓度的平行对照组实验，可得到图4。如图所示：随着底物浓度的逐渐升高，底物N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的e.e.s值一直维持在99%以上，但是所需反应时间开始加长，并且产率也有所下降；底物浓度为130.60mmol/L开始，即使延长时间，底物也无法完全反应，且产率也大幅下降；当底物浓度达到208.97mmol/L后，产率达到最低。这是因为当底物浓度较低，酶的活性中心未达到饱和，利用率较低。当底物浓度过高时，抑制了酶催化活性中心的活性，使得酶的活性中心结构发生了改变甚至是失活，使得酶促反应速率大大降低甚至停止。

所以选择酶催化反应的最佳底物浓度为52.24 mmol/L。此时底物e.e.s大于99%，E值为25.65，产物N-BOC-L-α-氨基丁酸的产率为35.58%。

2.4反应时间曲线

由图5所示：随着反应时间的加长，底物NBOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的e.e.s值、对映体选择率E值和水解产率也逐渐增大；在4 h以后，e.e.s值达到90%以上，5 h后达到98%，6 h后达到99%以上；在反应开始1 h后就开始有水解产物N-BOC-α-氨基丁酸生成；随着时间的加长，其水解产物产率逐渐增大，并且在6 h时达到最高；6 h之后反应继续进行，但其e.e.s值、E值和水解产率几乎维持不变，反应达到饱和。为了高效率地水解拆分底物，选择最优时间是6 h。在此条件下，底物e.e.s大于99%，E值为20.22，产物N-BOCL-α-氨基丁酸的产率为36.21%。

3　结论

通过对Aspergillus tamarii WYC3菌体水解动力学拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯反应的底物浓度、pH、温度和反应时间的研究，最终确定最优催化反应条件为：0.1mol/L pH 7.2的磷酸钾缓冲液中，反应温度30℃，底物浓度52.24mmol/ L，0.1 g菌粉，V（底物）∶V（丙酮）=1∶8，200 r/min恒温水浴反应6 h，可获得产物N-BOC-L-α-氨基丁酸，此时e.e.s值达到99.95%，对映体选择率E值为20.11，产率为36.21%。

本实验为获得L-α-氨基丁酸提供了一种新的生物酶水解方法，该反应条件温和、毒性小、产物产率较高、光学纯度高，对制备高效、专一的生物催化剂以及其进一步的工业生产应用奠定了坚实的实验基础。

［1］杨晟，范文超，陶荣盛，等.一种L-2-氨基丁酸的生产方法：102212567 A［P］.2011-10-12.

［2］白国义，陈立功，邢鹏，等.乙胺丁醇的合成［J］.精细化工，2004，21（12）：943-945.

［3］曹炜，郑小玲.抗癫痫药物左乙拉西坦的合成研究进展［J］.齐鲁药事，2012，31（10）：602-604.

［4］尹先清，孙芳，葛胜祥.α-氨基丁酸化学合成研究进展［J］.精细化工中间体，2010，40（1）：12-14.

［5］周先波，徐广宇，周伊，等.抗疯痈治疗药物左乙拉西坦的合成研究［J］.精细化工中间体，2005，35（2）：27-28.

［6］CHIYUKIF.Process for production of（+）-2-amino-1-butanol：3979457［P］.1976-09-07.

［7］WATSONH B.Reactionsof halogenswith compounds containing the carbonyl group［J］.Chemical reviews，1930，7（2）：173-201.

［8］奚强，林丫丫.2-氨基丁酸的的合成［J］.武汉工程大学学报，2007，29（4）：15-17.

［9］JEFERY E A，MEISTERSA.Electrochemical synthesis of amino acids by reductive amination of keto acids.Reduction at mercury electrodes［J］.Australian journal of chemistry.1978，31 （1）：73-78.

［10］毛建卫，崔艳丽，王桂仙.DL-α-丙氨酸合成工艺的新进展及其应用［J］.科技通报，2002，18（2）：93-95.

［11］韩冰，徐良，熊林，等.一种不对称转换法制备L2-氨基丁酸的方法：200910212533.5［P］.2009-10-21.

［12］MALIK M S，PARK E S，SHIN JS.ω-Transaminase-catalyzed kinetic resolution of chiral amines using l-threonine as an amino acceptor precursor［J］.Green chemistry，2012，14（8）：2137-2140.

［13］奚强，丁友友，林丫丫，等.2-氨基丁酸的酶拆分［J］.武汉工程大学学报，2009，31（3）：26-29.

［14］SEO Y M，MATHEW S，BEA H S，et al.Deracemization of unnatural amino acid：homoalanine using d-amino acid oxidase andω-transaminase［J］.Organic and biomolecular chemistry，2012，10（12）：2482-2485.

［15］GOTOR-FERNÁNDEZ V，BRIEVA R，GOTOR V.Lipases：Useful biocatalysts for the preparation of pharmaceuticals［J］. Molecular catalysis B：Enzymatic.2006，40（3/4）：111-120.

［16］ABDEL-FATTAH Y R，GABALLA A A.Identification and over-expression of a thermostable lipase from Geobacillus thermoleovorans Toshki in Escherichia coli［J］.Microbiological research.2008，163（1）：13-20.

［17］李琴，鄢洪德，郑建勇，等.无溶剂体系脂肪酶Lipozyme TL IM催化拆分DL-薄荷醇［J］.发酵科技通讯，2015，44（4）：15-18.

（责任编辑：朱小惠）

Preparation of N-L-α-am inobutyric acid by biocatalytic hydrolysis

WANG Yuguang，YEQiujuan，WU Dongmei，WEIChun

（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Aspergillus tamarii strain WYC3 producing lipase was screened from soil samples，which showed high stereoselectivity and hydrolytic activity toward N-BOC-DL-α-amino butyric acidmethyl ester.The high enantiomeric excess（e.e.s）of 99.95%and enantiomeric ratio（E value）of 20.11 were achieved when the yield of N-BOC-L-α-amino butyric acid reached 36.21%.The reaction conditionswere optimized as follows：pH 7.2，temperature 30°C and 200 r/min，substrate concentration 52.24 mmol/L，biocatalyst powder 0.1g and V（substrate）∶V（acetone）=1∶8.

N-BOC-DL-α-amino butyric acid methyl ester；N-BOC-L-α-amino butyric acid；Aspergillus tamarii WYC3；asymmetric hydrolysis；process optimization.

TQ033

A

1674-2214（2016）03-0129-04

2016-03-08

王宇光（1972—），男，内蒙古包头人，副教授，博士，研究方向为化学与生物制药，E-mail：yuguangw@zjut.edu.cn.