透明质酸工业发酵染菌分析与处理

宋磊，孟国庆

（菏泽学院生命科学系，山东菏泽274015）

透明质酸工业发酵染菌分析与处理

宋磊，孟国庆

（菏泽学院生命科学系，山东菏泽274015）

染菌是透明质酸工业发酵生产中最为棘手的问题，同时也是直接影响产品质量、提取收率和成本的关键因素。提出了透明质酸发酵染菌的检测方法，从染菌时间、类型、范围三方面探讨透明质酸发酵染菌的原因，并根据实际生产经验，分别从菌种、空气、管路配置、系统死角清理、培养基灭菌、车间环境等方面明确防止发酵染菌的具体措施，得出了斜面菌种、种子罐、发酵罐不同时期染菌后的补救措施。

透明质酸；发酵；染菌；预防和处理

透明质酸（hyaluronic acid，简称HA）是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸通过β-1，4和β-1，3糖苷键反复交替连接而成的高分子聚合物。由于其独特的流变学特性、黏弹性、保湿性以及良好的生物相容性，透明质酸在化妆品领域、医学领域有着广泛的应用［1］。透明质酸用于食品还处于起步阶段，近年来国内外关于HA口服后吸收、代谢和功效的研究越来越多，大量科学证据证明了其功效。特别是2008年5月，国家卫生部按照《新资源食品管理办法》的规定发布相关公告，批准透明质酸钠作为一种新资源食品用于保健食品原料，这一公告的发布必将进一步推动HA在我国保健食品中的应用。

目前，透明质酸的获得主要有两种方法：从动物组织中提取和利用微生物发酵生产。动物组织提取原料来源少、提取成本高、环境污染大；而微生物发酵法可以利用微生物大量生产透明质酸，工艺简单且提取成本较低，具有更广阔的发展前景，是目前透明质酸生产的主要方法。

透明质酸发酵最常用的菌株是营养缺陷型兽疫链球菌，属于兼性厌氧菌，在有氧和无氧情况下都可以生长。在发酵过程中，链球菌的培养温度、pH、溶氧等条件都非常适宜其他细菌的生长，同时透明质酸发酵培养基营养异常丰富，无任何抑制细菌生长因子的存在，进一步增加透明质酸发酵染菌的可能性。发酵染菌对透明质酸生产影响很大，轻则影响透明质酸发酵产率，增加提取纯化的难度，降低产品的质量；重则倒罐，扰乱企业的正常生产秩序，破坏生产计划。因此避免染菌是透明质酸生产企业的一项重要工作内容。本文结合实际生产情况，介绍近两年来山东某生物公司透明质酸发酵过程中染菌判定方法、原因、预防途径和补救措施。

1　透明质酸发酵染菌检测方法

透明质酸发酵周期短，本公司所用菌种为马疫链球菌，发酵周期一般为18～24 h，杂菌生长速率明显高于生产菌株。如能及时发现染菌，根据本菌株生长特性以及感染杂菌的时间、类型相对应调控发酵培养的条件，遏制杂菌生长，就有可能避免倒罐的发生。因此及时准确的检测杂菌方法对透明质酸发酵有重要的影响。透明质酸发酵最快速的检测方法是显微镜镜检法［2］，如镜检判定染菌后应立即相对应调控培养条件。平板划线法作为辅助验证染菌的方法，比镜检法能检出更多的杂菌，但培养周期长（需要过夜），可以为日后染菌原因分析提供一定的依据。肉汤检测法主要用于无菌空气的检测。

1.1显微镜镜检法

从发酵罐无菌取样后直接涂于载玻片上，置于油镜下观察菌种的形态特征，注意要不断反复调整视野的宽度和深度进行仔细观察，如在一个视野中发现两个及以上的游动杆菌应判定为染菌。对于不动杆菌，首先观察其透明度，如整个菌体透明状态不一，可判定为死杆菌，如不能确定，应立即做台盼蓝排斥实验，判断是否为死菌，并于半小时后取样观察该形态杂菌数量有无增加。

1.2平板划线法

1.2.1平板培养基

平板培养基为营养琼脂（琼脂、蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、酵母膏、氯化钠，pH 6.9～7.1），将其配好后121℃湿热灭菌25～30min，然后冷却至45～50℃倒入培养皿，冷却后置于37℃恒温箱内无菌培养24 h，挑出无菌落出现的平板备用。

1.2.2平板划线

将灭菌后发酵培养基和待测疑似染菌发酵液划线接种于多个平板中，置于37℃恒温培养箱中培养24 h后观察菌落形态特征，具体包括：颜色、透明度、湿润性、边缘整齐性、是否隆起、接种针挑起有无拉丝等。如多个平板中均出现同一种或几种不同于生产菌株的菌落特征的现象可判定为染菌。

1.3肉汤检验法

在确保无菌条件下，将无菌空气引入肉汤培养基中，可连续通气，然后置于37℃摇床中培养，如有浑浊现象发生，则发酵所用空气为带菌空气，容易造成发酵染菌。

2　透明质酸发酵染菌原因分析

2.1根据染菌类型分析

耐热性芽孢杆菌：由于透明质酸发酵培养基原料常含有一些固体难溶杂质异物，同时会添加一定量的有机硅油消泡剂，因此会导致培养基灭菌不彻底感染耐热性芽孢杆菌，另外，发酵罐中常会存在着一些死角也会造成发酵感染这类杂菌。

无芽孢不耐热游动杆菌：可能是由于种子带菌、空气过滤效率低、除菌不彻底、设备渗漏和操作问题等引起。

2.2根据染菌时间分析

由于透明质酸发酵培养基是高糖培养基，因此细菌生长调整期时间较长，故染菌常发现于发酵6 h以后。如染菌发生在发酵前期（即发酵6～10 h），多数是由于转种管道、补料管道灭菌不彻底，转料过程中操作不当，种子带杂菌或补料带杂菌导致；如染菌发生在中后期（即发酵12 h以后），多是由于空气过滤系统不严，设备渗漏，取样不当造成；发酵至16 h以后，发酵液黏度较大，溶氧较低，几乎没有发现染菌情况。

2.3根据染菌范围分析

发酵罐、种子罐如同时发现大面积染菌，多是由于原始菌种不纯或空气系统除菌不严导致；单个发酵罐连续染菌多是由于设备问题造成的，如设备存在死角、阀门内漏、机械密封不严等；而单个发酵罐偶尔染菌的原因最为复杂［3］，各种染菌的途径都可能引起。需根据实际情况，查看生产记录，逐个检查分析排除可能存在的问题。

现将山东某生物公司2014年透明质酸发酵染菌原因统计列表如下（统计包括种子罐、发酵罐）。

表1　透明质酸发酵染菌原因

3　透明质酸发酵染菌预防措施

3.1防止菌种带菌

3.1.1加强菌种室无菌环境管理

接种室为局部100级洁净区，需严格按照GMP有关洁净区规定进行管理［4］。除此之外，还应当做到每次无菌室使用后用紫外线照射30 min，并用0.1%的新洁尔灭及过氧乙酸等消毒液对环境及物品消毒。每隔一定时间对无菌室进行甲醛加高锰酸钾熏蒸。种子固体斜面在培养过程中瓶塞上往往会附着尘埃，而在接种、刮斜面制备菌悬液等无菌操作过程拔瓶塞时，灰尘很容易落进瓶内，造成种子带菌。应当把斜面培养间当作亚无菌区进行管理，每日坚持用干净湿抹布擦拭斜面培养间的地面及墙面。在充分消除对培养种子影响的情况下定期用消毒液（如0.1%的新洁尔灭、5%来苏尔等）对斜面培养间进行消毒，定期用紫外线照射消毒。

3.1.2不断纯化、复壮生产菌种

该厂所用菌种为营养缺陷型链球菌，容易回复突变为产透明质酸酶菌株，透明质酸酶可将透明质酸分解，影响透明质酸产率。此外生产菌株的纯化、复壮可确保无杂菌污染，因此需不断对生产菌种进行纯化、复壮。

3.2防止空气带菌

透明质酸发酵属于好氧发酵，在发酵前期需氧量较少，仅用于满足菌体生长繁殖需要，在发酵中后期需通入大量的无菌空气以刺激夹膜的产生［5］。所以保证空气无菌对透明质酸发酵有着重要的影响。为避免空气带菌可以从以下几个方面着手：1）严格按照空气过滤系统灭菌操作规程，定期对无菌空气系统进行彻底灭菌。过滤器消毒温度要控制在120～130℃，消毒时间30 min，各个排气阀全部打开不得留死角，消毒结束后一定要缓缓通入冷空气，速度不能太快，否则会造成过滤器损坏，通气1 h将过滤器吹干［6］。2）在罐体灭菌结束切入无菌空气降温过程中，一定要使无菌空气的压力高于种子罐、发酵罐的罐压，以防止发酵液倒流进入空气过滤系统。3）空气压缩机最好使用无油润螺杆空压机，防止油水去除不彻底进入过滤器，降低过滤器除菌效率。4）在进入前置高效过滤器之前使用换热器对无菌空气进行加热，进一步降低空气相对湿度。5）发酵罐前最好配置二级精细过滤器，进一步增强除菌效果。

3.3完善发酵车间管道布局、避免死角

管道布局应力求简单方便、利于操作、不得相互影响。每个罐体应单独设有独立的排气、排污管路。各种子罐和发酵罐转种管路最好一一对应，缩短输送距离。补料管路设分配站。罐体和有关管路应有利于蒸汽进行灭菌。对于转种、取样、补料等操作管路要有单独的灭菌系统，以便在发酵罐灭菌后或发酵过程中单独进行灭菌。死角是引起发酵染菌的一个重要因素，以下部位容易存在死角：管路连接焊缝、罐体内壁、搅拌桨、温度计和pH值探头插座焊缝、罐底积垢、靠罐一阀和法兰连接、压力表焊缝等［7］。根据实际生产需要，单个罐体内壁应做抛光镜面处理，管道焊缝光滑，转弯处应保持一定的弧度，法兰最好硬接触密封，定期清除罐内的积垢，防止罐底污垢积聚形成死角，温度计、pH值探头插座焊接要光滑，不得存在死角。

3.4规范培养基灭菌流程

培养基灭菌操作不当容易导致灭菌不彻底。在灭菌之前配料过程中应当将结块无机盐、葡萄糖、蛋白胨等原料充分溶解，去除不溶性异物颗粒，添加消泡剂以防泡沫污染杂菌。灭菌开始时，使用夹套预热，将罐内冷空气及低温的二次蒸汽排除干净。当罐温达到90℃，三路蒸汽同时进入，合理调整各路的进汽阀，确保各路进汽口的蒸汽有足够的压力，灭菌温度控制在（121±1）℃，保持25min以上的灭菌时间，充分灭菌。灭菌结束后，立即关闭所有阀门，及时通入无菌空气保压，防止因罐内蒸汽冷凝形成负压而吸气染菌。

3.5加强车间环境管理

发酵生产区最好有单独的区域同其他生产区隔离；保持发酵区的环境卫生，每次接种前30min关闭车间门窗，用消毒液喷雾消毒；环境定期用8～10mL/m3甲醛和4～5 g/m3高锰酸钾熏蒸消毒［8］。

4　透明质酸发酵染菌后补救措施

4.1茄形瓶固体斜面染菌

如发现斜面菌种已染菌，则将此批斜面菌种处理掉，重新选用保藏优良菌种进行划线接种。种子罐以及过滤器通气保压，待新接种固体斜面菌种具备接种条件后再进行接种。

4.2种子罐染菌

种子罐中如确认发生染菌，无论发生在培养前期还是后期，应立即实罐灭菌后排放。否则极易导致发酵罐倒罐，造成更大的损失。染菌后的罐体用甲醛等化学物质处理，再用蒸汽对附属设备进行灭菌。再次投料之前，认真分析原因，彻底清洗罐体以及附件，同时进行严密程度检查，以防渗漏杂菌，造成连续污染。

4.3发酵罐染菌

4.3.1发酵前期染菌

发酵前期要做到勤取样、多观察，如发现染菌，应将通气量调至0.1m3/h以下或停止通气，使pH自行下降至6.0以下，经上述处理1～3 h后观察菌种以及杂菌生长情况，如杂菌生长受到抑制，生产菌株成为优势菌，将pH重新调回7.0，逐渐增大通气量，待黏度达到一定程度之后，可完全调回通气量；反之，如经处理后杂菌生长未能受到抑制，而生产菌株也未能成为优势菌，应立即实罐灭菌，灭菌后操作步骤参照种子罐灭菌后操作步骤进行。此外，由于透明质酸发酵培养基是高糖培养基，葡萄糖和其他原料是分开灭菌的，因染菌再次实罐灭菌后，培养基中营养成分会受到严重破坏，颜色类似深咖啡色，重新接入的菌种生长慢、产率低、质量差，因此发酵前期如严重染菌应实罐灭菌后排放。

4.3.2发酵中后期染菌

发酵中后期染菌可适当调低通气量，降低转速，抑制杂菌生长，待残糖低于20 g/L，发酵液黏度达到6 000 mPa·s以上，可提前放罐，勿等残糖所剩无几时放罐，以免杂菌裂解，给后续提取纯化带来更大困难。如发酵液粘度低于4000mPa·s，且杂菌数量较大时则应倒罐，随后对空罐进行彻底灭菌与清理。

5　结论

以山东某生物公司2014—2015年实际生产情况为例（见表2），2014年该公司开始生产透明质酸，由于前期经验少，未能对透明质酸发酵染菌进行系统防治，染菌率达到了5.5%。期间不断总结经验教训，2015年该公司采用文中所述的染菌防治方法，透明质酸发酵染菌率降至1%，单罐平均产量提高3.2 kg，年产量提高超1.5 t，由此产生的经济效益超400万元。

表2　透明质酸发酵系统防治染菌前后对比表

染菌对透明质酸发酵十分不利，防止染菌是透明质酸发酵生产工作中的重中之重。生产技术人员应当高度重视，严格按照岗位SOP操作，把控生产每一环节、每一细节，做好常规检查和防治工作，善于发现和总结，设法防止染菌的发生。当然随着透明质酸发酵生产实践经验的累积，以及现代先进发酵相关设备的改进，新工艺、新技术的应用，相信透明质酸的发酵染菌率会大大降低，发酵水平也会越来越高。

［1］凌沛学.透明质酸［M］.北京：中国轻工业出版社，2000.

［2］储炬，李友荣.现代工业发酵调控学［M］.北京：化学工业出版社，2002.

［3］郝常明，赵建峰，黄雪菊.生物发酵染菌问题的探讨［J］.医药工程设计，2007，28（2）：11-15.

［4］熊宗贵.发酵工艺原理［M］.北京：中国医药科技出版社，2001.

［5］SHAH M V，BADLE S S，RAMACHANDRAN K B.Hyaluronic acid production and molecular weight improvement by redirection of carbon flux towards its biosynthesis pathway［J］.Biochemical engineering journal，2013，80（22）：53-60.

［6］吴剑波.微生物制药［M］.北京：化学工业出版社，2002.

［7］刘利.L-赖氨酸发酵过程染菌的途径和分析［J］.粮食与食品工业，2014，21（4）：66-69.

［8］黄雪菊，郝常明.阿维菌素发酵染菌问题的探讨［J］.农药，2007，46（10）：659-662.

（责任编辑：朱小惠）

Analysis and processing of bacterial contam ination during the industrial production of hyaluronic acid

SONG Lei，MENG Guoqing
（Departmentof Life Science，Heze University，Heze 274015，China）

Bacterial-infection is one of themost serious problems in the industrial fermentation of hyaluronic acid，and also a key factor that directly affects the quality，yield and cost of hyaluronic acid.This paper proposed the detectionmethods for bacterial contamination during hyaluronic acid fermentation.The causes of bacterial contamination were also discussed in view of time，type and range.Based on the actual production experiences，the ways to prevent infection were ascertained from preparation of strain，air purification，ductwork deployment，systematic dead angle cleaning，medium disinfection and workshop conditions.Meanwhile，the adjustment measures were summarized in different infected period such as strain，seed potand yeastiness.

hyaluronic acid；fermentation；bacterial contamination；prevention and treatment

TQ920

A

1674-2214（2016）03-0161-04

2016-04-15

山东省科技计划项目（2011GSF12114）

宋磊（1986—），男，安徽临泉人，助教，硕士，研究方向为微生物应用技术，E-mail：hzxysl007@163.com.