哈蟆油蛋白酶解物抗疲劳功效研究

潘黛安，张鹤，董颖，王珊，边帅，王秋，齐滨，赵雨，赵大庆（长春中医药大学，吉林长春130117）



基础研究

哈蟆油蛋白酶解物抗疲劳功效研究

潘黛安，张鹤*，董颖，王珊，边帅，王秋，齐滨，赵雨，赵大庆*
（长春中医药大学，吉林长春130117）

研究哈蟆油蛋白酶解物的抗疲劳作用。采用双酶法制备哈蟆油蛋白酶解物，以哈蟆油蛋白酶解物低、中、高剂量组和空白对照组连续给小鼠灌胃30 d，测定小鼠负重游泳时间、血清尿素含量、血乳酸含量和肝糖原含量。与空白对照组相比，各剂量组小鼠负重游泳时间均明显延长（P＜0.05），高、中剂量组小鼠游泳后血清尿素含量显著降低（P＜0.05），高剂量组小鼠游泳后3个时间点血乳酸曲线下面积均小于空白对照组（P＜0.05）；各剂量组小鼠肝糖原含量无显著性差异（P＞0.05）。哈蟆油蛋白酶解物具有缓解体力疲劳作用。

哈蟆油；蛋白酶解物；抗疲劳

哈蟆油［1］（Oviductus Ranae）是中国林蛙（Rana temporaria chensinensis David）雌蛙输卵管，采制后经干燥而得，又称“林蛙油”，吉林省为主产区，是我国特有的名贵中药材。哈蟆油味甘、咸，性平，具有补肾益精、健脾益胃、滋阴补肾、润肺生津等功效，对体弱气虚、精力耗损、记忆力不佳、神经衰弱等疗效较好，富有滋补“软黄金”的美誉。现代药理学研究表明哈蟆油具有提高机体免疫力［2］、抗氧化［3］、抗疲劳、抗应激等作用［4］。目前对于哈蟆油成分的研究发现，主要成分为蛋白质，约占总量的50%以上［5］。有学者将哈蟆油分为水溶性成分和非水溶性成分，分别进行抗疲劳试验研究，研究发现哈蟆油水溶性成分及其酶解物和非水溶性成分及其酶解物都具有抗疲劳功效，且酶解后抗疲劳功效进一步增强［6-9］。由于哈蟆油中的糖蛋白分子量大，黏度高，不易生产加工，采用蛋白酶酶解的方法可显著降低分子量，使其易于加工和人体消化吸收。但尚鲜有文献报道采用双酶法制备得到的哈蟆油酶解物的药理活性，因此本实验采用胃蛋白酶和碱性蛋白酶双酶法制备哈蟆油蛋白酶解物，研究酶解后哈蟆油蛋白的抗疲劳的作用，为哈蟆油的产品开发提供理论参考。

1　材料与方法

1.1试验药物

新鲜哈蟆油去除筋膜等杂质后阴干，粉碎成细粉，按料液比1∶100（g/mL）加入pH 4.5的柠檬酸溶液，浸泡36 h，匀浆后煮2 h，冷却至室温，用10 mmol/L HCl溶液调pH 2～3。采用最佳酶解工艺［10］，用柠檬酸浸提和水煎煮的方法提取哈蟆油蛋白，先按照酶与底物比1∶2 000（g∶g）加入胃蛋白酶酶解2 h，再按照酶与底物比1∶100（g∶g）加入碱性蛋白酶酶解6 h，离心，制得哈蟆油蛋白酶解物样品，哈蟆油蛋白酶解物的提取率为80%。

1.2实验动物

SPF级ICR雄性小鼠160只，体重18 g～22 g，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK-（吉）2011-0004；基础饲料由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，生产许可证号：SCXK-（吉）2010-0001；清洁级动物室环境设施合格证号：吉动设字10-1005号，实验动物使用许可证号：SYXK（吉）2010-0011。

1.3试剂

尿素测定试剂盒：深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；血乳酸测试酶膜：山东省科学院生物研究所；肝糖原试剂盒：南京市建成生物工程研究所。

1.4仪器

游泳箱（50 cm×50 cm×40 cm）；秒表；AB135-S型电子天平：梅特勒-托利多公司；ALC2100电子天平：艾科勒公司；722分光光度计：上海奥析科学仪器有限公司；TBA-120FR型全自动生化分析仪：日本东芝；SBA-40C型生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所。

1.5方法

1.5.1动物分组与剂量选择

将160只小鼠随机分为4大组（n=40），分别用于负重游泳实验、血清尿素氮测定、血乳酸测定、肝糖原测定，每个大组随机分为4个小组（n=10），按哈蟆油蛋白酶解物人服用剂量的1、10、30倍设置剂量组，分别为0.52、5.20、15.60 mg/10 g×BW×d，空白对照组给予生理盐水，连续灌胃30 d。

1.5.2负重游泳实验

末次给予受试样品30 min后，将小鼠尾根部负荷5%体重的铅皮，置游泳箱中游泳，水深约30 cm，水温（25±1）℃。实验时水槽内同时放入低、中、高剂量组和空白对照组小鼠各一只。记录小鼠自开始游泳至死亡的时间［11］，即小鼠的负重游泳时间（min）。

1.5.3血清尿素测定

末次给予受试样品30 min后，在游泳箱中不负重游泳90 min，水温（30±0.5）℃，休息60 min后，小鼠摘眼球采血。置于4℃中静置3 h，分离血清，进行尿素含量测定。采用日本东芝TBA-120FR型全自动生化分析仪测定。

1.5.4血乳酸测定

末次给予受试样品30 min后，用毛细管眼球内眦取血20 μL，然后使小鼠在水温为（30±0.5）℃的游泳箱中不负重游泳10 min。分别于游泳后立即（游泳后0 min）和游泳后休息20 min各采血20 μL，采用山东省科学院生物研究所生产的生物传感分析仪测定以上3个时间点的血乳酸值。（溶血剂及测定液均由该所提供）。以3个时间点血乳酸曲线下面积判断结果：3个时间点血乳酸曲线下面积（mmol/L）=5×（游泳前血乳酸值+3×游泳后0 min血乳酸值+2×游泳后休息20 min血乳酸值）

1.5.5肝糖原测定

末次给予受试样品30 min后处死小鼠，取肝脏，以生理盐水洗涤后，用滤纸吸干多余水分，精确称取肝脏75 mg，每管加入225 μL试剂盒提供的碱溶液，用簿膜封住管口，扎一透气孔，沸水浴20 min，冷却后加入7.2 mL蒸馏水，充分混匀，按试剂说明书操作加入显色剂，沸水浴5 min，用722分光光度计在620 nm波长进行比色测定，按如下公式换算肝糖原。

1.6结果判定标准

负重游泳实验结果阳性，血乳酸、血清尿素、肝糖元/肌糖元3项生化指标中任2项指标阳性，可判定该受试样品具有缓解体力疲劳的作用。

1.7数据处理

采用SPSS11.5统计软件，通过单因素方差分析进行统计学处理，试验结果表示为。

2　结果

2.1哈蟆油蛋白酶解物对小鼠负重游泳时间及小鼠增重的影响

哈蟆油蛋白酶解物对小鼠负重游泳时间及小鼠增重的影响见表1。

由表1可见，经口给予小鼠不同剂量的哈蟆油蛋白酶解物30 d，各实验组小鼠增重与空白对照组比较无显著性差异（P＞0.05），高、中剂量组游泳时间长于空白对照组，且差异有极显著性（P＜0.01），低剂量组游泳时间长于空白对照组，且差异有显著性（P＜0.05）。说明哈蟆油蛋白酶解物能延长小鼠负重游泳时间而对小鼠增重无影响。

表1　哈蟆油蛋白酶解物对小鼠负重游泳时间及小鼠增重的影响（）Table 1　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on swimming time and weight gain in mice（）

表1　哈蟆油蛋白酶解物对小鼠负重游泳时间及小鼠增重的影响（）Table 1　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on swimming time and weight gain in mice（）

注：*为与空白对照组比较P＜0.05；**为与空白对照组比较P＜0.01。

组别　动物数/只　剂量/（mg/10 g×BW×d）　始重/g　终重/g　增重/g　游泳时间/min空白对照　10　19.6±0.8　36.5±1.8　16.9±1.8　6.97±2.46哈蟆油蛋白酶解物　10　0.52　19.8±1.3　37.0±3.5　17.3±3.5　7.43±1.73*哈蟆油蛋白酶解物　10　5.20　19.7±1.1　36.6±2.7　17.0±2.3　8.49±2.35**哈蟆油蛋白酶解物　10　15.60　20.0±1.3　36.8±3.6　16.8±3.1　11.11±3.37**

2.2哈蟆油蛋白酶解物对小鼠血清尿素及小鼠增重的影响

哈蟆油蛋白酶解物对小鼠游泳后血清尿素及小鼠增重的影响见表2。

表2　哈蟆油蛋白酶解物对小鼠游泳后血清尿素及小鼠增重的影响（）Table 2　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on serum urea and weight gain in mice after swimming（）

表2　哈蟆油蛋白酶解物对小鼠游泳后血清尿素及小鼠增重的影响（）Table 2　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on serum urea and weight gain in mice after swimming（）

注：*为与空白对照组比较P＜0.05。

组别　动物数/只　剂量/（mg/10 g×BW×d）　始重/g　终重/g　增重/g　血清尿素/（mmol/L）空白对照哈蟆油蛋白酶解物哈蟆油蛋白酶解物哈蟆油蛋白酶解物10 10 10 10 0.52 5.20 15.60 20.3±1.1 20.6±0.8 20.2±1.2 20.2±1.1 37.1±2.6 36.4±2.2 36.6±2.4 36.3±2.1 16.8±2.1 15.8±2.1 16.4±2.1 16.1±2.2 10.65±1.20 10.55±1.62 9.91±1.13* 9.17±1.62*

由表2可见，经口给予小鼠不同剂量的哈蟆油蛋白酶解物30 d，各实验组小鼠增重与空白对照组比较无显著性差异（P＞0.05），高、中剂量组小鼠游泳后血清尿素低于空白对照组，且与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.05），说明哈蟆油蛋白酶解物具有抑制小鼠游泳后血清尿素升高的作用而对小鼠增重无影响。

2.3哈蟆油蛋白酶解物对小鼠血乳酸值及小鼠体重的影响

给予哈蟆油蛋白酶解物小鼠游泳前、后及休息20 min 3个时间点血乳酸值见表3。

表3　给予哈蟆油蛋白酶解物小鼠游泳前、后及休息20 min 3个时间点血乳酸值（）Table 3　The blood lactic acid levels of three time points before swimming，after swimming and 20 min after resting in mice of giving Oviductus Ranae protein hydrolyzate（）

表3　给予哈蟆油蛋白酶解物小鼠游泳前、后及休息20 min 3个时间点血乳酸值（）Table 3　The blood lactic acid levels of three time points before swimming，after swimming and 20 min after resting in mice of giving Oviductus Ranae protein hydrolyzate（）

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哈蟆油蛋白酶解物对小鼠3个时间点血乳酸曲线下面积及小鼠增重的影响见表4。

由表4可见，经口给予小鼠不同剂量的哈蟆油蛋白酶解物30 d，各实验组小鼠增重与空白对照组比较无显著性差异（P＞0.05），高剂量组小鼠游泳后3个时间点血乳酸曲线下面积有所降低，与空白对照组比较有显著性差异（P＜0.05），说明哈蟆油蛋白酶解物能够抑制游泳时血乳酸的产生而对小鼠增重无影响。

表4　哈蟆油蛋白酶解物对小鼠3个时间点血乳酸曲线下面积及小鼠增重的影响Table 4　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on the areas under the curve of the three time points of blood lactic acid and weight gain in mice

2.4哈蟆油蛋白酶解物对小鼠肝糖原含量及小鼠增重的影响

哈蟆油蛋白酶解物对小鼠肝糖原含量及小鼠增重的影响见表5。

表5　哈蟆油蛋白酶解物对小鼠肝糖原含量及小鼠增重的影响（）Table 5　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on the content of hepatic glycogen and weight gain in mice（）

表5　哈蟆油蛋白酶解物对小鼠肝糖原含量及小鼠增重的影响（）Table 5　Effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate on the content of hepatic glycogen and weight gain in mice（）

组别　动物数/只　剂量/（mg/10 g×BW×d）　始重/g　终重/g　增重/g　肝糖原/（mg/g肝组织）空白对照哈蟆油蛋白酶解物哈蟆油蛋白酶解物哈蟆油蛋白酶解物10 10 10 10 0.52 5.20 15.60 20.4±1.3 19.7±1.2 20.1±1.0 20.2±1.3 37.0±2.5 37.1±3.2 36.8±3.4 36.7±2.7 16.5±3.2 17.4±2.9 16.7±3.3 16.5±2.4 35.43±6.87 35.63±8.89 36.04±9.68 36.45±10.73

由表5可见、经口给予小鼠不同剂量的哈蟆油蛋白酶解物30 d，各实验组小鼠增重与空白对照组比较无显著性差异（P＞0.05），各剂量组肝糖原储备与空白对照组比较无显著性差异（P＞0.05），即哈蟆油蛋白酶解物对增加肝糖原储备和小鼠增重未见影响。

3　讨论

疲劳是一个复杂的生理状态，是脑力或体力消耗到一定程度时必然出现的一种正常的生理现象。产生疲劳的主要原因是能源物质的消耗和代谢物质的堆积［12］。所谓抗疲劳，就是通过一些方法手段补充能源物质或加速堆积物质的代谢。如可以依靠营养物质的补充、中医药疗法来消除机体疲劳，也可以通过休息、睡眠及某些物理方法等达到抗疲劳的目的［13］。为避免营养物质的补充影响小鼠体重进而影响受试样品的抗疲劳功效，因此本实验中分别对给予受试样品后小鼠体重的差异进行了测量。

机体运动可以加速能源物质的消耗，因此通过运动，即小鼠负重游泳的时间长短来反应机体疲劳的程度。本研究结果表明，服用哈蟆油蛋白酶解物可明显延长小鼠负重游泳时间，且高、中剂量的哈蟆油蛋白酶解物可显著延长小鼠负重游泳时间而对小鼠增重无影响。尿素是氨基酸蛋白质在体内分解代谢的最终产物之一，运动后血清尿素的含量会明显升高。高、中剂量组小鼠游泳后血清尿素含量均明显降低，低剂量组与空白对照组相比无显著性差异，说明哈蟆油蛋白酶解物具有抑制小鼠游泳后血清尿素升高的作用而对小鼠增重无影响。乳酸是造成运动性疲劳的重要原因，机体运动消耗糖原，糖原分解产生大量乳酸，乳酸在肌肉中堆积，造成机体疲劳，因此，减少血液中乳酸的产生。本研究中高剂量组可明显抑制小鼠游泳时血乳酸的产生，各剂量组对小鼠增重无显著性差异。糖原是机体运动的主要能量来源，而肌糖原作为储备能量，其含量的减少可直观的反应出疲劳发生的程度［14］。本研究中各剂量组对小鼠体重及增加肝糖原储备均未见影响。

根据1.6项下结果判定标准：负重游泳实验结果阳性，血乳酸、血清尿素、肝糖元/肌糖元3项生化指标中任2项指标阳性，可判定该受试样品具有缓解体力疲劳的作用。实验结果显示，小鼠负重游泳试验为阳性，血清尿素和血乳酸2项生化指标为阳性，因此可判定哈蟆油蛋白酶解物能提高机体运动耐力，改善机体能量代谢，降低血乳酸含量，从而延缓疲劳的产生和加速疲劳的消除，具有抗疲劳功效。本实验研究结果进一步证明了哈蟆油蛋白酶解物酶解物的抗疲劳功效，为哈蟆油中主要成分蛋白酶解物的保健品开发提供了理论参考。

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Study on the Anti-fatigue Effect of Oviductus Ranae Protein Hydrolyzate

PAN Dai-an，ZHANG He*，DONG Ying，WANG Shan，BIAN Shuai，WANG Qiu，QI Bin，ZHAO Yu，ZHAO Da-qing*
（Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin，China）

Researching the anti-fatigue effect of Oviductus Ranae protein hydrolyzate.Using double enzyme to prepare Oviductus Ranae protein hydrolyzate.Four doses of Oviductus Ranae protein hydrolyzate with low，medium and high dose group and a blank control group were applied to mice continuously for 30 d.Then measured loaded swimming time，serum urea content，blood lactic acid content and hepatic glycogen of mice.Compared with blank control group，the loaded swimming time of mice of each dose group was significantly prolonged（P＜0.05），the serum urea content after swimming of mice of high and middle dose groups were both significantly lower（P＜0.05），the areas under the curve of the three time points of blood lactic acid after swimming of mice of high dose group were lower than the blank control group（P＜0.05），the hepatic glycogen content of each dose group was no significant differences（P＞0.05）.Oviductus Ranae protein hydrolyzate had the effect of relieving physical fatigue.

Oviductus Ranae；protein hydrolyzate；anti-fatigue

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.001

吉林省医药产业发展引导资金项目（20150311031YY）

潘黛安（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：中药有效成分研究。

张鹤（1985—），女，助理研究员；赵大庆（1963—），男，教授。

2015-07-07