沙棘籽蛋白酶解物抗氧化作用初探

王茂广

(临沂大学，临沂 276005)

沙棘(sea buckthorn)为胡颓子科沙棘属落叶灌木［1］。我国是沙棘属植物分布区面积最大、种类最多的国家［2］。沙棘籽中蛋白质、维生素等有效成分具有清除人体自由基、提高机体免疫功能的作用，在医药、保健和食品领域具有广阔的发展前景［3］。沙棘籽中的氨基酸种类齐全，包含人体全部的必需氨基酸［4］。近年来，与蛋白质有关的抗氧化的研究已引起食品科学界的高度关注。Rozenn［5］已从鲤鱼酶解物中提取出抗氧化活性肽。丁利君等［6］采用枯草杆菌碱性蛋白酶酶解液，以清除羟自由基的效果为分析指标，研究了非洲鲫鱼蛋白酶解物的抗氧化能力。目前对沙棘浆果和种子的利用仅限于制作饮料和提取沙棘油，而对于沙棘籽的抗氧化作用尚未见报道［7］。本研究对沙棘籽蛋白酶解物的抗氧化能力进行初步研究，为沙棘资源在医药、保健品方面的应用进行探索，为沙棘籽蛋白酶解物作为天然抗氧化剂和功能性食品的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

沙棘籽:内蒙古水域山饮品有限责任公司;碱性蛋白酶:南宁庞博生物工程有限公司;氯化硝基四氮唑蓝、四甲基乙二胺、核黄素、硫代巴比妥酸、维生素C、2，6－二叔丁基对甲酚:天津博迪化工有限公司。化学试剂均为分析纯。

微型植物试样粉碎机:河北黄骅市齐家务科学仪器厂;752紫外分光光度计:上海光谱仪器有限公司;TGL－16B台式离心机:上海安亭科学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 沙棘籽蛋白酶解物的制备

称取沙棘籽10 g，粉碎过筛除去杂质，用无水乙醇浸泡12 h，于40℃下烘干，将处理后的沙棘籽和1 mol/L NaOH按照1∶10的比例搅拌匀质，37℃下水浴2 h，4 000 r/min离心15 min，得到上清液，加入水杨酸调pH 4.8进行酸沉，4 000 r/min离心15 min后，得到蛋白沉淀后风干。将沙棘蛋白溶于蒸馏水中，加碱性蛋白酶，在料液比1∶10，加酶量260 U/g，60℃下水解2 h，然后在100℃下灭酶5 min［8］，获得水解度为22%的蛋白质酶解液。试验中沙棘籽蛋白溶液的浓度通过考马斯亮蓝法测定，根据牛血清蛋白标准曲线，得到的蛋白提取液中粗蛋白的浓度约为 4 mg/mL。分别配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL质量浓度的沙棘蛋白酶解液，以相同浓度的维生素C作为对照组。

1.2.2 沙棘籽蛋白酶解物还原能力的测定

加入0.2 mol/L pH 6.6的混合磷酸盐缓冲液和1%K3Fe(CN)6溶液各2.5 mL并混合均匀，混合液在50℃下反应20 min后自然冷却，采用六氰合铁酸钾法［9］，于700 nm处测定吸光度。

1.2.3 沙棘籽蛋白酶解物抗脂质过氧化活性的测定

采用亚油酸加速氧化法［10］。

1.2.4 沙棘籽蛋白酶解物对羟基自由基引发DNA氧化损伤的保护作用

采用硫代巴比妥分光光度法［11］。

1.2.5 沙棘籽蛋白酶解物对超氧阴离子自由基的清除

利用核黄素(RFV)、四甲基乙二胺(TEMED)光化学反应产生O2－·，O2－·可将氯化硝基四氮唑蓝(NBT)还原为蓝色产物，试验采用刘平等［12］提供的方法。

1.2.6 沙棘籽蛋白酶解物对羟基自由基的清除

采用D－脱氧核糖－Fe体系法［13］。不同浓度梯度的蛋白酶解液2 mL，依次加入9 mmol/L FeSO4溶液2 mL，9 mmol/L水杨酸溶液2 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O22 mL启动整个反应，37℃水浴30 min，并作空白试验，以蒸馏水作参比，在510 nm下测定吸光度。

1.2.7 沙棘籽蛋白酶解物对DPPH自由基的清除

吸取2 mL样液到试管中，加2 mL 0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液，室温静置20 min，于517 nm处测定吸光度。以空白作参比，清除率按下式计算［14］。

清除率(%)=［1－(A－A1)/A0］×100

式中:A0为DPPH与无水乙醇吸光度;A1为样品与无水乙醇吸光度;A为样品与DPPH吸光度。

2 结果与分析

2.1 沙棘籽蛋白酶解物还原能力的测定

沙棘籽蛋白酶解物和维生素C的还原能力如图1所示。沙棘籽蛋白酶解物质量浓度在0.2～0.8 mg/mL的范围内，还原能力随着浓度的增大而增大，质量浓度增大到1.0 mg/mL时，还原能力有所下降，原因可能是该浓度下沙棘籽蛋白酶解物提供的还原基团有限，相同浓度沙棘籽蛋白酶解物的还原能力低于维生素C。通过本试验得出沙棘籽酶解物抗氧化能力最适酶解液质量浓度约为0.8 mg/mL。

图1 沙棘籽蛋白酶解物还原能力的测定

2.2 沙棘籽蛋白酶解物的抗脂质过氧化活性

由图2可以看出，沙棘籽蛋白酶解物抗脂质过氧化活性随着浓度的增大而增大，且呈现出很强的剂量效应，在1.0 mg/mL时其抗脂质过氧化活性可达30%。可见，沙棘籽蛋白酶解物具有一定的抗脂质过氧化能力。本试验中样品的抑制率较低的原因，可能是沙棘籽蛋白酶解物在亚油酸体系中没有很好的分散，在溶解蛋白质过程中造成蛋白质的游离羟基减少。

图2 沙棘籽蛋白酶解物的抗脂质过氧化活性

2.3 沙棘籽蛋白酶解物对羟基自由基引起DNA损伤的保护作用的测定

羟基自由基能攻击DNA的戊糖和碱基，引起链的断裂。不同浓度沙棘籽蛋白酶解液对羟基自由基引起DNA损伤的保护作用不同，试验以抑制率为参考指标，由图3可以看出，随着沙棘籽蛋白酶解液浓度的增大，其对DNA损伤的抑制率越大，最大约为70%。与维生素C相比，在0.2～0.8 mg/mL的质量浓度范围内，其抑制率略小或与之相当，表明沙棘籽蛋白酶解物对羟基自由基引起DNA损伤的保护能力较强。羟基自由基致DNA损伤的化学反应机制十分复杂，本方法是一种体外评价抗氧化剂对DNA损伤保护作用的方法，该方法是否可以用于体内试验，尚待研究。

图3 沙棘籽蛋白酶解物对羟基自由基引起DNA损伤的抑制率

2.4 沙棘籽蛋白酶解物对超氧阴离子自由基清除率的测定

从图4可以看出，在试验浓度范围内，沙棘籽蛋白酶解物对超氧阴离子的清除作用逐渐增强，且清除率与样品液的浓度呈现出一定的线性规律，从0.2 mg/mL时的10.4%增长到1.0 mg/mL时的81.7%。张红城等［13］研究茶花花粉蛋白酶解物的抗氧化能力表明，各个水解度下其清除能力均随着样品浓度的增加而增加。试验表明，沙棘籽蛋白酶解物呈现出较好的清除超氧阴离子自由基的能力。

图4 沙棘籽蛋白酶解物对超氧阴离子自由基清除率的测定

2.5 沙棘籽蛋白酶解物对羟基自由基清除率的测定

从图5可以看出，待测样品和对照组对羟基自由基的清除率均随着试样浓度的提高而增大，并且2条清除曲线大致重合，在1.0 mg/mL质量浓度下对羟基自由基的清除率都接近60%，表明在质量浓度0.2～1.0 mg/mL范围内，沙棘酶解物对羟基自由基的清除作用与维生素C大致相当。

图5 沙棘籽蛋白酶解物对羟基自由基清除率的测定

2.6 沙棘籽蛋白酶解物对DPPH自由基清除率的测定

从图6可以看出，在试验浓度范围内，沙棘籽蛋白酶解物对DPPH自由基的清除率并没有随酶解物浓度的变化产生大的差异。相同浓度沙棘籽蛋白酶解液对DPPH自由基的清除率小于维生素C，但在试验浓度范围内，其抑制率也保持在60%左右。

图6 沙棘籽蛋白酶解物对DPPH自由基清除率的测定

3 结论

本研究以沙棘籽为研究对象，通过碱溶法提取沙棘蛋白，获得沙棘蛋白酶解物。通过测定对超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基的清除率，其最高的清除率分别达到81.7%、60%、65.2%，较为全面地反映沙棘籽蛋白酶解物的抗氧化性能，为今后的应用奠定了理论基础。另外，试验测定了沙棘蛋白酶解物对羟基自由基引起DNA损伤的保护作用，为沙棘蛋白抗氧化修复再生细胞机能的衡量提供理论依据，同时在其抗氧化方面进行了探究。

［1］张郁松，罗仓学.沙棘资源开发与沙棘黄酮提取［J］.食品研究与开发，2005，26(3):46 －47

［2］Beveridge T，Li T S C，Oomah B D.Sea buckthorn products:manufacture and composition［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1999，47:3480 －3488

［3］张文博，库尔班江，张焱.新疆野生沙棘种仁蛋白的提取和氨基酸分析［J］.粮油加工，2008:56－58

［4］刘玉珍，于丽娟.沙棘药理作用综述［J］.中国科技信息，2009(16):182－185

［5］Rozenn Ravallec P.Influence of the hydrolysis process on the biological activities of protein hydrolysate from cod muscle［J］.Journal of Science of Food and Agriculture，2000，80:2176－2178

［6］丁利君，何颖基，梁燕.非洲鲫鱼蛋白酶解物的抗氧化研究［J］.食品研究与开发，2009，30(11):1－5

［7］史春艳，左夏林，丁宇.超氧化物歧化酶修饰改造的研究进展［J］.中国老年杂志，2009(13):1723－1724

［8］赵晨伟.沙棘分离蛋白提取工艺研究［J］.粮食与食品工业，2009，16(6):33 －35

［9］Gow Chin Yen，Chen Hui Yin.Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity［J］.Journal ofAgricultural and Food Chemistry，1995，43(1):27 －32

［10］张赟彬，龚钢明，戴妙妙.甘薯多酚粗提取液的抗氧化活性研究［J］.中国粮油学报，2007，22(5):76－79

［11］曹炜，陈卫军，郑晓晖，等.一种评价天然抗氧化剂对羟自由基致DNA损伤保护作用的改进方法［J］.营养学报，2008，30(1):74 －77

［12］刘平，李云雁，罗渊，等.板栗壳棕色素对活性氧自由基的清除作用［J］.食品科技，2007(2):175－178

［13］张红城，李慧岩，董捷，等.茶花花粉蛋白酶解物抗氧化性的研究［J］.食品科学，2007，28(8):58－61

［14］朱振宝，田宾，易建华.金银花不同提取物的油脂抗氧化效果研究［J］.食品发酵与工业，2008，34(2):69－72.