糖尿病大鼠骨骼肌内脂素和磷脂酰肌醇3激酶的表达*

张　晗,张安星,高　琳,阳　琰,廖　鑫,李明泽,杨孟雪

(遵义医学院附属医院内分泌科，贵州遵义 563003)



论著·基础研究

糖尿病大鼠骨骼肌内脂素和磷脂酰肌醇3激酶的表达*

张晗,张安星,高琳△,阳琰,廖鑫,李明泽,杨孟雪

(遵义医学院附属医院内分泌科，贵州遵义 563003)

目的观察糖尿病大鼠骨骼肌中内脂素(visfatin)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的表达，探讨visfatin在糖尿病中的作用及可能机制。方法8周龄雄性SD大鼠55只(造模成功39只)，采用随机数字表法分为4组：正常对照组(A组)10只，饮食诱导肥胖组(B组)10只，血糖未控制糖尿病组(C组)10只，血糖控制糖尿病组(D组)9只。喂养至12周末，测定空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)、空腹胰岛素(FINS)，计算稳态模型评估的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)及胰岛素敏感指数(ISI)；RT-PCR测定骨骼肌组织visfatin、PI3K mRNA表达；Western blot测定骨骼肌组织visfatin、PI3K蛋白表达。结果C组FBG较A、B组明显增高(P<0.01)；D组FBG较C组明显降低(P<0.01)。B组TG较A组明显增高(P<0.05)；C组TG、TC、LDL-C、FFA较A、B组明显增高(P<0.01)；D组TG、TC、FFA较A组明显增高(P<0.05)；D组TG较A、B组明显增高(P<0.05)；D组TG、TC、LDL-C、FFA较C组明显降低(P<0.01)。B、C组较A组FINS、HOMA-IR明显增高，ISI明显降低(P<0.01)，C组较B组FINS、HOMA-IR明显增高，ISI明显降低(P<0.01)。C、D组visfatin mRNA和蛋白表达较A组均明显增高(P<0.05)，C组visfatin蛋白较B组明显增高(P<0.01)。C组PI3K mRNA和蛋白表达较A、B组均明显降低(P<0.01)，D组PI3K mRNA和蛋白表达较A组均明显降低(P<0.05)。结论visfatin在骨骼肌中的表达水平与骨骼肌糖脂代谢状态有关，可能通过PI3K参与骨骼肌糖脂代谢的调节。

1-磷脂酰肌醇3-激酶；糖尿病；肥胖症；肌,骨骼；内脏脂肪素；SD大鼠

我国糖尿病患者群数量占据全球的1/3，极大地加重了社会及家庭的负担，但该病的发病机制至今尚未完全阐明。内脂素(visfatin)主要在内脏脂肪中高表达，在肝脏、骨骼肌等组织中亦有表达[1]。visfatin作为胰岛素抵抗(IR)、糖尿病及其他代谢性疾病的影响因素，已成为近年来研究的热点。众多研究均认为其在糖尿病的发生、发展中具有一定作用，但关于visfatin与肥胖、糖脂代谢、IR的关系一直存有争议，具体作用机制尚不明确。开展visfatin的相关研究对于糖尿病的发病机制、预防及治疗具有重要意义。

骨骼肌作为胰岛素的主要靶器官之一，是机体廓清葡萄糖最主要的组织，能摄取、消耗人体80%～90%的葡萄糖[2]，其糖代谢状态与机体IR密切相关。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是胰岛素信号传导级联反应中关键信息分子，介导胰岛素刺激葡萄糖的转运和摄取。本实验通过建立肥胖大鼠及糖尿病大鼠模型，予胰岛素进行干预使各组大鼠处于不同的血糖水平，观察各组大鼠骨骼肌组织中visfatin、PI3K的基因及蛋白表达的变化，以进一步了解visfatin在骨骼肌糖脂代谢中的作用、与PI3K的关系及作用机制，以期为糖尿病的发病机制及治疗提供新的视点。

1　材料与方法

1.1材料8周龄健康雄性SD 大鼠55只，体质量(200±20)g，购自第三军医大学大坪医院野战外科研究所动物实验中心，动物许可证号为SCXK(渝)2007-0005。

1.2方法

1.2.1分组大鼠适应性喂养1周后按照数字随机表法分为4组：正常对照组(A组)10只，饮食诱导肥胖组(B组)15只，血糖未控制糖尿病组(C组)15只，血糖控制糖尿病组(D组)15只。A组和B、C、D组大鼠分别采用普通饲料和高脂高糖饲料喂养。以空腹体质量大于A组平均体质量的20%即作为B组大鼠造模成功标准，共计成模10只。8周后C、D组禁食12 h测空腹体质量，按40 mg/kg的体质量标准一次性腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)，A、B组按40 mg/kg的标准腹腔内注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1 mmol/L，pH 4.4)，以2次空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L作为C组成模标准，共计成模10只。D组大鼠糖尿病成模后予腹部皮下注射低精蛋白锌胰岛素注射液进一步建立D组大鼠模型，以FBG<11.1 mmol/L作为成模标准，共计成模9只。

1.2.2标本留取各组大鼠喂养至12周末，麻醉状态下腹主动脉取血，用于血脂、胰岛素测定。分离大鼠右后肢股四头肌组织并置于Trizol中，后转移保存于-80 ℃冰箱，以备后续逆转录PCR(RT-PCR)测定visfatin、PI3K的基因表达；其余置于液氮罐中，移入-80 ℃冰箱冻存用于Western blot测定visfatin、PI3K的蛋白表达。

1.2.3生化指标及胰岛素测定使用强生稳步倍加型血糖仪及配套试纸测定FBG。使用AU2700型全自动生化检测仪检测血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，酰基辅酶A氧化酶比色法测游离脂肪酸(FFA)；采用放射免疫法(RIA)测定血清空腹胰岛素(FINS)，变异系数小于5%。稳态模型评估的IR指数(HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5；胰岛素敏感指数(ISI)=1/(FINS×FBG)。

1.2.4骨骼肌visfatin基因、蛋白测定

1.2.4.1RT-PCR法测骨骼肌组织visfatin、PI3K mRNA表达从-80.0 ℃冰箱中取出含有1 mL Trizol液体的骨骼肌(约50 mg)，采用Trizol一步法提取总RNA。按照说明书进行逆转录上述液体混匀后放入Mastercycler Gradient PCR仪进行逆转录反应，合成cDNA第1链。反应分为两个阶段：逆转录反应阶段(37.0 ℃，15 min)和逆转录酶失活反应阶段(85.0 ℃，5 s),选取61.6 ℃为各引物退火温度。分别以各组cDNA为模板进行扩增，以β-actin为内参，引物由TaKaRa生物工程公司合成。由GeneBank查出相关引物序列。visfatin正义链5′-TAC TGT GGC GGG AAT TGC TCT AA-3′，反义链5′-CCA CAG ACA CAG GCA CTG ATG A-3′；PI3K 正义链5′-AGC TCC TGG AAG CCA TTG AGA A-3′，反义链5′-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3′；β-actinz正义链5′-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3′，反义链5′-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3′。

1.2.4.2Western blot法测骨骼肌组织visfatin、PI3K蛋白表达分别提取各组骨骼肌组织，使用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后剪碎，加入RIPA强效裂解液(碧云天生物技术有限公司)，超声震碎，裂解4 ℃匀浆，提取上清液按BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性(100 ℃，5 min)后上样电泳，转膜，封闭，加入visfatin一抗过夜孵育后，加入二抗摇床中孵育1 h，洗膜，显影。电泳电转使用美国BIO-RAD公司电泳系统，visfatin抗体由美国Biovision公司提供。骨骼肌组织PI3K及其对应的β-actin蛋白检测步骤同上。凝胶成像系统拍照，扫描蛋白条带灰度值并定量分析。

2　结　　果

2.14组大鼠一般及生化指标比较B、D组大鼠内脏脂肪重量/体质量较A组明显增高(P<0.01)，C、D组大鼠内脏脂肪重量/体质量较B组明显降低(P<0.01)，D组大鼠内脏脂肪重量/体质量较C组明显增高(P<0.01)；C组FBG 较A、B组明显增高(P<0.01)，D组FBG较C组明显降低(P<0.01)；B组TG较A组明显增高(P<0.05)，C组TG、TC、LDL-C、FFA较A、B组均明显增高(P<0.01)，D组TG较B组明显增高(P<0.05)，D组TG、TC、LDL-C、FFA较C组明显降低(P<0.01)。B、C组较A组FINS、HOMA-IR明显增高，ISI明显降低(P<0.05)，C组较B组FINS、HOMA-IR明显增高，ISI明显降低(P<0.01)，见表1。

2.24组大鼠骨骼肌visfatin、PI3K mRNA和蛋白表达比较C、D组visfatin mRNA和蛋白表达较A组均明显增高(P<0.05)，C组visfatin蛋白较B组明显增高(P<0.01)。C组PI3K mRNA和蛋白表达较A、B组均明显降低(P<0.01)，D组PI3K mRNA和蛋白表达较A组均明显降低(P<0.05)，见表2、图1。

表1　　4组大鼠一般指标及生化指标比较±s)

续表1　　4组大鼠一般指标及生化指标比较±s)

-：无数据。a:P<0.05，b:P<0.01，与A组比较；c:P<0.05，d:P<0.01，与B组比较；e:P<0.01，与C组比较。

表2　　4组大鼠骨骼肌visfatin、PI3K mRNA和蛋白表达比较

a:P<0.05，b:P<0.01，与A组比较；c:P<0.01，与B组比较。

图1　　4组大鼠骨骼肌组织visfatin和PI3K蛋白表达比较

3　讨　　论

近年的研究表明，visfatin与糖尿病和IR关系密切，提示visfatin可能通过与胰岛素不同的结合部位和作用方式激活胰岛素受体(InsR)，进而激活胰岛素信号转导通路，发挥类胰岛素样作用[1]。2型糖尿病(T2DM)的发病基础是骨骼肌、脂肪、肝脏的IR和胰岛素β细胞功能缺陷，visfatin在骨骼肌、肝脏、骨髓、胎膜等组织中均有表达。本实验以高脂高糖饮食联合腹腔注射小剂量STZ建立糖尿病大鼠模型，实验发现C、D两组糖尿病大鼠骨骼肌组织visfatin mRNA表达量较A组均明显增高，C组visfatin蛋白表达量较A、B组均明显增高，可能是由于代偿性的高胰岛素血症未能将血糖维持在正常水平，骨骼肌中visfatin表达增加或许是血糖增高的一种代偿，而胰岛素干预治疗后糖脂代谢紊乱得到了明显改善，骨骼肌visfatin基因和蛋白表达较C组并无明显变化，visfatin并不随机体糖代谢变化而发生急剧变化，前期研究也验证了这点。Harasim等[3]在体外培养比目鱼肌和伸趾长肌两种骨骼肌细胞，用胰岛素、visfatin及两者联合分别进行孵育，发现visfatin仅在伸趾长肌细胞中增加了骨骼肌的葡萄糖转运，且转运作用远低于胰岛素，提示visfatin在骨骼肌糖代谢中并不起主要作用，可能 visfatin在骨骼肌葡萄糖代谢中的作用十分有限，这与本实验的研究一致，毕竟生理状态下血浆中visfatin浓度仅为胰岛素浓度的3%～10%。研究亦显示小鼠血浆visfatin在糖负荷前后无明显改变，短暂的血糖改变对其并无影响[1]。但Krzysik-Walker等[4]对4周龄、8周龄小鸡的研究发现，相对于内脏脂肪组织，骨骼肌visfatin表达水平明显增高，且8周龄高于4周龄，考虑与此时期肌肉快速增长有关，进而提示visfatin可能作为一种肌肉来源的脂肪因子影响骨骼肌生长代谢及胰岛素敏感性。骨骼肌visfatin的表达和作用可能与物种、骨骼肌种类等因素均有关，关于骨骼肌visfatin的产生、作用及作用机制均有待于进一步深入研究。后续试验将进一步观察visfatin在KKAy小鼠骨骼肌中的表达，对其在骨骼肌的糖脂代谢机制作更进一步的探讨。

研究证实血和骨骼肌中FFA异常聚集可导致骨骼肌IR，肥胖、糖耐量异常，T2DM患者肌细胞内脂质水平均较健康者增高，且随其水平逐渐增高，机体胰岛素敏感性呈下降趋势[5]。前期实验中T2DM大鼠血浆visfatin和血清FFA较A组均明显增高，且两者呈显著正相关，与本实验结果一致。骨骼肌中visfatin表达水平的增高可能是机体对FFA异常蓄积所致的骨骼肌IR的一种拮抗机制。visfatin可显著增加前脂肪细胞中TG的合成和聚集，并增强过氧化物酶体增生物激活受体γ激动剂(PPAR-γ)、脂肪酸合成酶、脂联素等脂肪标记物的表达，提示visfatin可能通过自分泌或旁分泌作用于脂肪组织[1,6-7]。本研究发现visfatin在B组大鼠骨骼肌中的表达较A组虽有增高趋势而差异无统计学意义，这与Kloting等[8]的研究结论一致。虽然本实验中骨骼肌visfatin表达量在B组与A组间无明显差异，但这并不能代表机体整体visfatin水平与肥胖的关系，可能 visfatin主要在内脏脂肪中高表达，而骨骼肌中表达较少，其机制需要更深入的研究。

骨骼肌是机体廓清葡萄糖最主要的组织[3]，研究显示T2DM大鼠骨骼肌和肝脏组织中PI3K基因表达调控有缺陷[9]，肥胖的T2DM大鼠骨骼肌中PI3K活性降低且P85α亚基表达减少[10]，高脂饮食诱导的IR小鼠骨骼肌中PI3K基因表达明显降低[11]。visfatin的分泌通过PI3K和蛋白激酶B途径，受胰岛素和葡萄糖的调控，葡萄糖可增加体外培养的人皮下脂肪细胞visfatin的表达，添加PI3K抑制剂共培养可减弱葡萄糖对visfatin表达的促进作用，提示PI3K信号通路参与visfatin表达调控[12]。糖尿病Wistar大鼠存在PI3K蛋白表达缺损，腹腔注射visfatin重组蛋白后PI3K和GLUT4蛋白水平增高[13]。本实验中与A、B组相比较，C组骨骼肌visfatin蛋白表达明显增高，同时PI3K mRNA和蛋白表达明显降低，D组PI3K mRNA表达较A组降低，visfatin可能与胰岛素信号调节通路及其糖脂代谢有一定关系。

综上所述，糖尿病大鼠骨骼肌visfatin的基因及蛋白表达均明显增高，可能在IR及糖尿病的发生、发展中发挥一定的作用。visfatin可能通过PI3K途径参与骨骼肌糖脂代谢的调节，进一步深入研究可能为糖尿病预防和治疗提供新的思路。

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The expression of visfatin and phosphatidylinositol 3-kinase isoforms in skeletal muscle of diabetic rats*

ZhangHan,ZhangAnxing,GaoLin△,YangYan,LiaoXin,LiMingze,YangMengxue

(DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003，China)

ObjectiveTo observe the expression of visfatin and phosphatidylinositol 3-kinase isoforms(PI3K) in skeletal muscle of diabetic rats,and to explore the function and the possible mechanism of visfatin in diabetes mellitus.MethodsThirty-nine 8-week-old male SD rats were randomly divided into four groups which were normal control group (group A,n=10),diet-induced obesity group (group B,n=10),blood glucose not control diabetes group (group C,n=10) and blood glucose control diabetes group(group D,n=9).After 12 weeks fed,FBG,triglyceride(TG),total cholesterol(TC),low density lipoprotein cholesterol(LDL-C),free fat acid(FFA) and fasting insulin(FINS) were measured.The homeostasis model assessment (HOMA-IR) and insulin sensitivity index(ISI) were calculated.The expression of visfatin and PI3K mRNA in skeletal muscle tissue were detected by RT-PCR,and the expression of visfatin and PI3K protein were determined by Western blot.ResultsFBG of group C was significantly higher than those of group A and B(P<0.01);FBG of group D was significantly lower than that of group C(P<0.01);TG of group B was significantly higher than that of group A(P<0.05).TG,TC,LDL-C,FFA of group C was significantly higher than those of group A and B(P<0.01);TG,TC,FFA of group D was significantly higher than those of group A(P<0.05);TG of group D was significantly higher than those of group A and B(P<0.05);TG,TC,LDL-C,FFA of group D was significantly lower than those of group C(P<0.01).Comparing with group A,FINS,HOMA-IR of group B and C were significantly higher and ISI were significantly lower (P<0.01);comparing with group B,FINS,HOMA-IR of group C was significantly higher and ISI was significantly lower (P<0.01).The expression of visfatin mRNA and protein in skeletal muscle of group C and D were significantly higher than those of group A (P<0.05),while visfatin protein of group C was significantly higher than that of group B(P<0.01).The expression of PI3K mRNA and protein in skeletal muscle of group C were lower than those of group A and B(P<0.01),PI3K mRNA and protein of group D were lower than those of group A(P<0.05).ConclusionThe expression level of visfatin in skeletal muscle is relevant to skeletal muscle glucose and lipid metabolism state.Visfatin might involved in glucose and lipid metabolism regulation through PI3K in skeletal muscle.

1-phosphatidylinositol 3-kinase；diabetes mellitus；obesity；muscle,skeletal；visfatin；SD rats

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.006

贵州省社会发展攻关项目[SY(2013)3033]；贵州省科技合作项目[(2010)7004]。作者简介：张晗(1986-)，主治医师，硕士，主要从事糖尿病及并发症研究。△

，E-mail:lgzymc@sina.com。

R587.1

A

1671-8348(2016)14-1889-04

2015-11-15

2016-01-25)