13C-呼气诊断试剂甘氨酸[1-13C]的合成研究

邱　俊，李虎林， 姜永悦

(上海稳定性同位素工程技术研究中心，上海化工研究院，上海　200062)



13C-呼气诊断试剂甘氨酸[1-13C]的合成研究

邱俊，李虎林， 姜永悦

(上海稳定性同位素工程技术研究中心，上海化工研究院，上海200062)

该合成方法以乙酸[1-13C]为原料，经过Hell-Volhard-Zelinski反应和乙醇酯化得到2-溴乙酸乙酯[1-13C]，接着经过Gabriel反应得到N-乙酸乙酯邻苯二甲酰亚胺[1-13C]，然后再与肼解和盐酸水解得到13C-呼气试验诊断试剂甘氨酸[1-13C]。同时还探索了关键中间体乙酸乙酯[1-13C]合成工艺，考察了温度、红磷用量和缚酸剂等主要因素，得到了最优合成工艺，使得最终产物甘氨酸[1-13C]总收率为58.4%，化学纯度高于98%以上，13C原子丰度高于98%。

13C-呼气试验；甘氨酸[1-13C]；Hell-Volhard-Zelinski反应；Gabriel 反应；合成工艺

目前13C-呼气试验已经较广泛地应用于消化不良等疾病的胃动力测定、胃动力药物的疗效观察、延缓胃排空药物不良反应的监测，以及胃部手术后的胃动力恢复情况评价[1]。同时也逐渐地应用于糖尿病胃轻瘫患者胃动力检测，合理地指导口服降糖药物的用量。以及特护患者及婴儿的胃动力检测，指导口服营养或胃管营养，这样可以减少特护时间，有效地避免脓毒败血症休克的发生[2]。

甘氨酸[1-13C]作为一种13C-呼气试验诊断试剂，在胃内不会分解吸收，以原型进入十二指肠后迅速被吸收并经肝脏代谢为13CO2排出，可作为检测胃对食物排空的示踪剂。因此，13C-甘氨酸呼气试验目前用于液体食物的胃排空速率的测定[3]。其优势在于稳定同位素碳13标记甘氨酸无放射性，可在短期内进行重复的检测；此外还具有操作简便，试验的灵敏度高、特异性好、重现性好等优点。因此甘氨酸[1-13C]在临床检测液体食物胃排空速率的应用中具有良好的发展前景[4-9]。

目前文献报道合成甘氨酸[1-13C]的方法主要是利用13C-甲基镁碳酸酯和硝基甲烷反应得到2-硝基乙酸[1-13C]，再经过钯/碳加氢还原得到甘氨酸[1-13C]，三步反应总收率为39.4%[10]。而本工作旨在开发另外一种简单高效的甘氨酸[1-13C]合成方法，主要采用乙酸[1-13C]为原料，先进行溴素溴化，然后与乙醇酯化，再与邻苯二甲酰胺钾盐反应得到N-乙酸乙酯邻苯二甲酰亚胺[1-13C]，然后进行肼解和盐酸水解得到目标产物甘氨酸[1-13C]，该方法与文献报道方法相比，具有原材料便宜，操作简单，成本低，收率更高等特点。

1　实　验

1.1仪器与试剂

ARX400核磁共振仪，美国Bruker公司；WRS-1B数字熔点仪，上海精密科学仪器有限公司；Waters液相色谱仪，美国Waters公司；MAT271气体同位素质谱计，美国Finnigan公司；RE-52B旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

乙酸[1-13C]：美国CIL公司，13C丰度98.5%；邻苯二甲酰胺钾盐：自制；溴素、红磷、水合肼：国药集团化学试剂有限公司；其他试剂和溶剂均为市售AR级。

1.2合成路线

图1　甘氨酸[1-13C]合成路线

1.3合成方法

1.3.1溴代乙酸乙酯[1-13C]的合成[11]

在100 mL三口烧瓶上，安装球形冷凝管和溴化氢气体吸收装置(NaOH水溶液)，在反应瓶中加入乙酸[1-13C] (3.05 g 50 mmol)、红磷(0.81 g，25 mmol)，磁力搅拌下油浴升温至118 ℃，待稳定后缓慢滴加溴素(5.25 mL，100 mmol)，滴完后保温反应，待红棕色褪去，颜色变成淡黄色后移去油浴，冷却至室温，加入50 mL乙酸乙酯，在5 ℃以下搅拌，分批缓慢加入三聚磷酸钠(9.2 g，25 mmol)，加入完毕，在常温搅拌15 min，再将无水乙醇(3.45 g，75 mmol)置于恒压滴液漏斗中缓慢滴加，控制反应温度为室温，反应时间5 h，反应完成后过滤，滤液用饱和Na2CO3溶液洗涤至中性，二氯甲烷萃取水溶液。合并有机相用无水Na2SO4干燥过夜，过滤，浓缩蒸掉有机溶剂，得到亮黄色油状液体溴代乙酸乙酯[1-13C]，产率为88.3%。1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm): δ 4.24(q,J=7.6 Hz, 2H,-O-CH2), 3.82(s, 2H, Br-CH2-), 1.31(t,J=7.2 Hz, 3H,-CH3); IR值 (KBr, cm-1): 2963, 2861, 1741, 1465, 1170, 721。

1.3.2N-乙酸乙酯邻苯二甲酰亚胺[1-13C]的合成

在100 mL三口瓶中，加入4.18 g(25 mmol)溴代乙酸乙酯[1-13C]和25 mL DMF，然后再加入邻苯二甲酰亚胺钾盐4.55 g (25 mmol)，室温下搅拌12 h，反应液倒入500 mL冰水中，有固体析出，过滤，滤饼用水洗(3×20 mL)，固体在60 ℃真空干燥箱中烘6 h，得到5.17 g N-乙酸乙酯邻苯二甲酰亚胺[1-13C]白色固体产品，反应产率为84.1%。m.p.110～111 ℃；1H-NMR (400 MHz, CDCl3, ppm)) δ: 7.82～7.90 (m, 2 H), 7.72～7.77 (m, 2 H), 4.56 (s, 2H-N-CH2-C=O), 4.23 (q,J=7.2 Hz, 2H,-O-CH2), 1.30(t,J=7.2 Hz, 3H,-CH3); IR值 (KBr, cm-1): 3011, 2832, 1737, 1480, 1405, 1329, 1216, 705。

1.3.3甘氨酸[1-13C]的合成[12]

在100 mL三口瓶中，加入3.51 g (15 mmol) N-乙酸乙酯邻苯二甲酰亚胺[1-13C]、60 mL甲醇和30 mmol 85%的水合肼，反应加热回流，搅拌2 h，反应液冷却至室温，反应中有固体析出，过滤，滤饼用甲醇洗(3×20 mL)，滤液蒸干得淡黄色固体，再加入50 mL盐酸(6 N)，反应加热回流，搅拌2 h后，冷却到0 ℃，过滤除去析出物，减压蒸去盐酸水溶液，以2 mol/L NaOH水溶液中和至中性，在0 ℃放置过夜，析出的白色结晶固体，过滤，固体在60 ℃真空干燥箱中烘6 h，得甘氨酸[1-13C]纯品78.6%，液相色谱分析纯度：98.7%，同位素质谱分析13C原子丰度为98.1%。m.p. 232～234 ℃;1H-NMR (400 MHz, D2O, ppm) δ: 3.76 (s, 2 H, N-CH2-);13C-NMR (100 MHz, D2O, ppm) δ: 173.3(-CO-), 43.4(N-CH2-); IR值 (KBr, cm-1): 3106, 2605, 2172, 1597, 1395, 1333, 929, 685; M/z: 77.3 (M+H)+。

2　结果与讨论

2.1反应温度对溴代乙酸乙酯[1-13C]产率的影响

首先利用乙酸[1-13C]与溴素通过Hell-Volhard-Zelinski反应得到活性高的溴代乙酰溴[1-13C]中间体，然后中间体再与乙醇酯化得到溴代乙酸乙酯[1-13C]，第二步反应常温下反应速率快，不易有副产物生成，在这里不做温度考察。因此主要考察第一步反应温度对溴代乙酰溴[1-13C]产率的影响，产物溴代乙酸乙酯[1-13C]反应收率利用HPLC峰面积计算。

选取溴化反应温度为80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、118 ℃(乙酸沸点)。实验结果如表1所示。

表1　温度对溴化反应的影响aTable 1　The effects of temperature on brominationa

a乙酸(50 mmol)、红磷(25 mmol)、溴素(100 mmol)、无水乙醇(75 mmol)、三乙胺(25 mmol)。

从表1数据可以看出，在100～118 ℃范围内，温度的升高，溴代乙酸乙酯产率迅速提高。当温度达到118 ℃时，乙酸回流状态下，产率达到最高。因此118 ℃乙酸回流为最优反应温度条件。

2.2红磷用量对溴代乙酸乙酯产率的影响

众所周知，Hell-Volhard-Zelinski反应最为常用的催化剂为三溴化磷，然而三溴化磷的蒸气与液体都具有强烈刺激性和腐蚀性，不易称取和操作。故参考文献报道方法[11]，选用性质稳定且相对便宜的红磷与溴素代替三溴化磷。实验证明，磷与溴素代替三溴化磷催化反应的效果相似。因此考察红磷的投入量对反应收率的影响，按照乙酸(3.0 g, 50 mmol)，当量取红磷的投入量为0.2 equiv(0.32 g)、0.3 equiv(0.48 g)、0.4 equiv(0.65 g)、0.5 equiv(0.80 g)、0.6 equiv(0.96 g)。实验结果如表2所示。

表2　红磷用量对溴化反应的影响aTable 2　The effects of phosphorus dosage on brominationa

a乙酸(50 mmol)、溴素(100 mmol)、无水乙醇(75 mmol)、三乙胺 (25 mmol)，118 ℃反应。

从表2中可以看出，红磷用量摩尔比从0.2 equiv逐步增加到0.5 equiv时，产率随之增加，当摩尔比为0.5 equiv时，产率达到最高82.6%。同时当红磷用量超过0.5 equiv时，对产品收率影响不明显。因此选择催化剂红磷用量摩尔比为0.5 equiv (0.8 g)。

2.3缚酸剂对溴代乙酸乙酯产率的影响

在溴代乙酰溴中间体与乙醇进行酯化反应中，需要加入碱作为缚酸剂中和反应中生成的溴化氢气体，使得酯化反应更完全。本论文将考察各种缚酸剂对酯化反应收率的影响。实验结果如表3所示。

表3　缚酸剂对酯化反应的影响aTable 3　The effects of acid-accepters on brominationa

a乙酸(50 mmol)、红磷(25 mmol)、溴素(100 mmol)，无水乙醇(75 mmol)、缚酸剂(25 mmol)，118 ℃反应。

从表3中可以看出，缚酸剂对酯化反应的影响比较大，不加缚酸剂反应产率相对较低，加入有机碱三乙胺和吡啶作为缚酸剂，虽然能得到较好的收率，但是存在后处理分离困难等缺点。当加入无机碱碳酸钠作为缚酸剂，产率反而相对较低，而利用三聚磷酸钠作为缚酸剂，产率则达到最高产率88.3%。根据机理上分析1 mol三聚磷酸钠吸附2 mol溴化氢，产物仍显碱性，反应依然能在碱性环境下进行，因此产率最高。因此选择无机碱三聚磷酸钠作为缚酸剂

2.4溴代乙酸乙酯[1-13C]最优合成工艺

综上所述，由乙酸[1-13C]为起始原料合成溴乙酸乙酯[1-13C]的优化条件为：乙酸[1-13C] (3.05 g, 50 mmol)，红磷(0.80 g, 0.5 equiv)，反应温度为118 ℃，溴素(5.25 mL, 100 mmol)，三聚磷酸钠(9.2 g, 25 mmol)为缚酸剂，无水乙醇(3.45 g, 75 mmol)，常温反应5 h，结束反应。在此最优条件下进行5次平行验证，考察反应重现性。实验结果如表4所示。

从表4可以看出，同样条件下的5次平行试验结果波动较小，目标产品溴乙酸乙酯[1-13C]的产率比较稳定。该优化反应条件其重现性和可靠性均较高。

3　结　论

(1)以乙酸[1-13C]为原料，先后经过Hell-Volhard-Zelinski反应、Gabriel反应和肼解等三步反应制备得到目标产物甘氨酸[1-13C]，总收率为58.4%。

(2) 探索了关键中间体溴乙酸乙酯[1-13C]合成工艺，考察了温度、红磷用量和缚酸剂等主要因素，得到了最优合成工艺条件，5次平行试验结果显示该优化工艺具有重现性和稳定性。

(3) 甘氨酸[1-13C]经过熔点、LC、MS和IR检测，确认产品化学结构，化学纯度高于98%，13C原子丰度高于98%，13C同位素稀释效应小于0.5%。

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A Synthetic Method of the Diagnostic Reagent of13C-Glycine Breath Test

QIU Jun, LI Hu-lin, JIANG Yong-yue

(Shanghai Engineering Research Center of Stable Isotope, Shanghai Research Instituteofchemicalindustry,Shanghai200062,China)

The acetic acid [1-13C] was used as raw material to generate ethyl bromoacetate [1-13C] by Hell-Volhard-Zelinski reaction and esterification reaction. Subsequently, N-phthaloyl glycine ethyl ester[1-13C] was obtained from ethyl bromoacetate[1-13C] by Gabriel reaction, then reacted with hydrazine hydrate to produce the diagnostic reagent glycine[1-13C]. The influences of parameters, such as temperature, the mole ratio red phosphorus to acetic acid [1-13C], acid-accepters on the yield of products, were investigated, and the optimized conditions were obtained. The yield of glycine[1-13C] was above 58.4%, the purity≥98%, the abundance of 13C≥98%.

13C-breath test; glycine[1-13C]; Hell-Volhard-Zelinski reaction; Gabriel reaction; synthesis technology

邱俊(1984-)，男，博士，工程师，主要从事同位素标记药物研发。

O628.2+1

A

1001-9677(2016)013-0084-03