长春新碱诱导白血病MOLT-4细胞凋亡及其机制研究

2016-09-02董如男

西南国防医药 2016年3期

董如男

董如男

目的观察长春新碱（VCR）对人急性淋巴细胞性白血病MOLT-4细胞促凋亡作用，并探讨其作用机制。方法分别用0、0.01、0.02、0.04、0.08μmol/L长春新碱处理MOLT-4细胞，然后用CCK-8法检测细胞活性，用Hochest33258对细胞核进行染色，用Rhodam ine123对细胞进行染色，检测线粒体膜电位情况。用caspase 8、9、3抑制剂预处理MOLT-4细胞，检测caspase8、9、3对细胞活性的影响。结果长春新碱对细胞活性具有抑制作用，且呈明确的剂量-效应关系；细胞核染结果显示，长春新碱可以促进细胞凋亡，剂量越大，凋亡现像越明显；同时，长春新碱可以引起细胞线粒体膜电位下降，并发现caspase 9和3参与了细胞凋亡过程。结论长春新碱可以促进MOLT-4细胞凋亡，作用机制可能是线粒体膜电位下降，进而诱导caspase 9和3活化而促发细胞的凋亡。

长春新碱；凋亡；急性淋巴细胞性白血病；MOLT-4细胞

[Abstract]Objective To explore the apoptosis inducing effect of vincristine(VCR)on human acute lymphoblastic leukemia MOLT-4 cells and its mechanisms.Methods MOLT-4 cells were treated with 0,0.01,0.02,0.04,and 0.08μmol/L vincristine, respectively.The cell viabilitywas detected by CCK-8 assay.The nucleiwere stained by Hochest33258,and the cellswere stained by Rhodamine123.The mitochondrial membrane potential was detected.Caspase 8,9,and 3 depressant were used to pretreat MOLT-4 cells,and their effects on cytoactive were detected.Results Vincristine could inhibit the cytoactive and presented definite dose-effect relationship.The nucleistaining indicated that vincristine could promote the apoptosis.The larger the dose was,themore obvious the apoptosis presented.At the same time,vincristine could induce the decrease ofmitochondrialmembrane potential.In addition,itwas discovered caspase 9 and 3 joined the process of apoptosis.Conclusion Vincristine can promote the MOLT-4 cell apoptosis,which may bemediated by mitochondrialmembrane potential decrease that further induce the caspase 9 and 3 activation and cell apoptosis.

[Keywords]vincristine;apoptosis;acute lymphoblastic leukemia;MOLT-4 cell

长春花原产于地中海、印度和南美洲。而在中国，其主要在南方种植，如云南、广东、广西等地[1]。长春花是防治癌症的重要药物，据研究发现，目前已经从长春花中提取出100多种生物碱[2]。其中活性较高的主要为长春花碱和长春新碱[3]。而长春新碱是从长春花中提出的很重要的吲哚类生物碱，具有很强的抗癌症效果，对于寻求适当的方法进行体外抗肿瘤研究具有重要意义[4]。到目前为止，国内外研究发现，长春新碱对宫颈癌、结肠癌、乳腺癌等均有一定的抑制生长及诱导调亡的作用[5]。急性淋巴细胞性白血病是由于原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞在造血组织异常增殖，并浸润全身各组织脏器的一种造血系统恶性克隆性疾病[6]。儿童与成人均可能发生，居儿童恶性肿瘤性疾病的首位[7]。因此，寻找一种有效的抗白血病药物至关重要。本实验使用长春新碱来作用于人急性淋巴细胞性白血病MOLT-4细胞，并初步考察其抗肿瘤作用机制。

1　材料与方法

1.1主要材料长春新碱购买于上海华联制药有限公司(批号:050602A)；Cell counting kit-8(CCK-8)购买于日本同仁化学公司；Z-DEVD-FMK（caspase3抑制剂，氟甲基酮）、Z-IETD-FMK（caspase8抑制剂，氟甲基酮）、Z-LEHD-FMK（caspase 9抑制剂，氟甲基酮)和二甲基亚砜(DMSO)均购买于Sigma公司；Hochest33258试剂、Rhodamine123染料购买于碧云天生物技术有限公司。

1.2主要仪器酶标仪（SpectraMax M5）购买于Molecular Devices公司，激光共聚焦扫描显微镜（TCS-SP2）德国leica公司，流式细胞仪（EPIC.SXL）购买于美国Beckman公司。

1.3细胞系与细胞培养MOLT-4细胞来自于美国ATCC细胞库。细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于5%CO2、饱和湿度、37℃条件下进行培养。

1.4CCK-8法检测长春新碱对细胞活性抑制作用取对数生长期的细胞，倒去原来的培养液，加入胰蛋白酶消化细胞，在显微镜下观察；消化完成后，倒掉胰蛋白酶，加入培养液，并将细胞稀释成105个/ml的细胞悬液，接种到96孔培养板上，每孔加100μl细胞悬液，置于培养箱中培养。细胞培养24 h后，向96孔培养板上每个孔中加入不同浓度的长春新碱，每个药物浓度4个平行孔。置于培养箱中分别培养24、48、72 h。然后弃掉旧培养液，向96孔培养板上每个孔中加100μl含10%CCK-8的培养液，然后用微量振荡器振荡后，用酶标仪在450 nm检测波长测定吸光度值，计算抑制率。

2　结果

2.1长春新碱对细胞生长抑制的作用如表1，CCK-8法测定结果显示，0.01～0.08μmol/L的长春新碱分别作用MOLT-4细胞24、48、72 h后，均能抑制细胞的活性，具有剂量-时间依赖关系。经过比较，长春新碱处理24 h后，细胞活性抑制效果不明显；处理72 h，长春新碱对细胞的毒性太强，因此，选择48 h作为最佳细胞处理时间，计算得IC50值为0.037μmol/L。因此，选择0.04μmol/L作为中浓度，0.02和0.08μmol/L分别作为低浓度和高浓度。

表1　不同浓度长春新碱对M0 L T-4细胞生长的抑制作用（n＝4）

2.2共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况0.02、0.04、0.08μmol/L低中高3个浓度长春新碱分别处理细胞48 h后，Hochest33258细胞核染色结果见图1。低中高浓度的长春新碱均能引起细胞核质固缩，并形成凋亡小体。有凋亡小体的细胞被认为是凋亡细胞，经过细胞计数，统计出细胞凋亡率。结果见图2，低中高浓度长春新碱引起的细胞凋亡率分别为（35.6±4.1）%、（56.9±5.2）%、（71.6±3.9）%（P＜0.01）。

2.3长春新碱对细胞线粒体膜电位的影响经过Rhodamine123染色后，流式细胞仪检测到低中高浓度的长春新碱引起的线粒体膜电位下降的百分率分别为（21.3±3.6）%、（36.9±4.1）%、（64.5±2.9）%，不同浓度之间比较有统计学差异（P＜0.01）。

2.4caspase8、9、3抑制剂对细胞活性的影响长春新碱处理细胞之前，先用caspase 8、9、3抑制剂预处理细胞，然后用CCK-8法检测细胞活性，结果见表2。caspase 8预处理组的细胞活性与同等浓度的长春新碱处理的细胞活性无明显差异；而caspase 9和3预处理组的细胞活性显著高于同等浓度的长春新碱处理的细胞活性（P＜0.05）。

图2　细胞凋亡率检测与对照组（0μmol/L长春新碱）比较，①P＜0.01

3　讨论

长春新碱是夹竹桃科植物长春花中提取出的生物碱，具有良好的抗肿瘤作用[8]。目前其制剂已被作为临床抗肿瘤药物。大量研究表明，长春新碱可以抑制体外培养的肿瘤细胞的增殖，并直接杀伤肿瘤细胞[9]。目前国内外研究发现，某些抗癌药物中的一些化学基团可以使分子氧还原形成活性氧（比如O2-等），其可以诱导癌细胞凋亡[10]。当细胞内活性氧水平过高时，线粒体就会受到活性氧的氧化攻击，导致线粒体跨膜电位下降，此外还会促进caspase 9蛋白表达的上调，进而激活下游的caspase家族蛋白，如caspase 3等，促进细胞凋亡，并产生凋亡小体、引起DNA断裂等一系列凋亡反应[11]。

本课题以MOLT-4细胞为研究对象，考察长春新碱是否也能通过损坏线粒体这条渠道促使细胞凋亡。细胞核染色结果表明，长春新碱处理细胞后，细胞质浓缩，并形成了凋亡小体，这是典型的凋亡现象。Rhodamine123是线粒体膜电位特异性染料，通过流式细胞仪检测发现，长春新碱确实可以引起细胞线粒体膜电位的下降，并且具有浓度依赖性，证实了线粒体参与了长春新碱诱导的细胞凋亡过程。

caspase 8为凋亡外源途径的经典促凋亡蛋白，caspase 9为内源凋亡途径的典型促凋亡蛋白，caspase 3为caspase 8和9的下游凋亡执行蛋白。本研究通过caspase 8、9、3的抑制剂来特异性的抑制caspase 8、9、3，发现抑制caspase 9和3，都能提高长春新碱诱导的细胞凋亡率，而caspase 8抑制剂长春新碱诱导的细胞凋亡没有明显影响。因此推测长春新碱诱导的MOLT-4细胞内活性氧水平过高，导致线粒体跨膜电位下降并促进caspase 9蛋白表达的上调，然后激活下游的caspase 3，最终促发了细胞凋亡。

综上所述，长春新碱作为一线的抗癌药物，对人白血病T淋巴MOLT-4细胞具有良好的体外抑制效果，杀死细胞的方式为凋亡，其可能的机制为线粒体膜电位下降引起的内源性通路介导的凋亡。这为长春新碱用于人白血病T淋巴癌的治疗和研究提供了很好的理论依据。

表2　caspase8、9、3抑制剂对细胞活性的影响（n＝4）

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Research on apoptosis of leukemia MOLT-4 cells induced by vincristine and itsmechanism

Dong Runan Department of Hematology,Central Hospital ofWeinan City,Weinan,Shaanxi,714000,China

R 733.7

1004-0188（2016）03-0278-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.03.017

714000陕西渭南，渭南市中心医院血液科

1.5共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况取对数生长期的细胞，将细胞制成浓度为105个/ml的细胞悬液，接种到共聚焦培养皿中，置于培养箱中培养。细胞培养24 h后，向培养皿中加入不同浓度的长春新碱，每个药物浓度4个平行皿。继续培养48 h后，弃掉旧培养液，加入10μM的Hochest33258染液，在培养箱中孵育30 min，然后用PBS清洗细胞3遍，再用共聚焦显微镜观察细胞核变化，并统计不同形态细胞核百分率。

1.6流式细胞仪检测长春新碱对细胞线粒体膜电位的影响取对数生长期的细胞，将细胞制成浓度为105个/ml的细胞悬液，接种到6孔板中，置于培养箱中培养。细胞培养24 h后，向培养皿中加入不同浓度的长春新碱，每个药物浓度4个平行孔，继续培养48 h，然后用消化液消化细胞并分散成细胞悬浮液。用5μM的Rhodamine123避光染色10min，再用2000 r/min离心5min，去掉上清液，再用PBS重悬浮细胞，并用200目的尼龙筛过滤细胞，最后上流式细胞仪检测细胞中Rhodamine123的荧光强度。

1.7caspase抑制剂对细胞生长的影响取对数生长期的细胞，消化细胞并将细胞稀释成浓度为105个/m l的细胞悬液，接种到96孔培养板上，每孔加细胞100μl悬液，置于培养箱中培养。细胞贴壁后，分别加入caspase8、9、3抑制剂预处理3 h，然后去掉旧培养液加入不同浓度的药物，继续培养48 h。再用CCK-8法检测细胞活性。

1.8统计学方法所有数据采用SPSS 10.0统计软件处理。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差异具有统计学意义。