荧光探针技术在谷胱甘肽检测中的应用

朱，和思扬，窦言东

（浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014）

荧光探针技术在谷胱甘肽检测中的应用

（浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014）

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是细胞与组织内重要的活性小分子，在工业生产领域有着广泛的应用。谷胱甘肽具有重要的生产以及研究价值，因此如何对其进行高效且专一地检测已成为当前谷胱甘肽工业生产及其功能研究的重要课题。荧光探针作为一种新型的检测手段，具有灵敏度高、专一性强以及制备成本低等优点，被广泛应用于各类小分子检测。近年来，已经有诸多检测谷胱甘肽的荧光探针被报道，且均表现出良好的检测性能。对近些年来不同类型的谷胱甘肽探针进行综述并对其机理进行简要介绍。

谷胱甘肽；荧光探针；专一性检测

内源性生物硫醇类小分子是生物体所必须的一种活性物质，该类物质对调控机体氧化还原水平具有十分重要的意义［1-2］。在众多硫醇物质中，谷胱甘肽在机体内分布十分普遍，参与了诸多与氧化还原相关的重要代谢途径［3］，使细胞具有抗毒性作用，对细胞具有重要的防护作用［4-5］。同时，谷胱甘肽的异常代谢和许多疾病有密切关联，如白细胞损伤、肝脏与皮肤病、癌症、艾滋病等［6-7］。除此之外，谷胱甘肽也是一种重要的工业产品，并被越来越多地应用于医药保健产品、养生美容产品以及食品和饲料添加剂等。当前，谷胱甘肽的生产主要通过大规模发酵来实现。由于谷胱甘肽在工业和生物医学等领域具有十分重要的价值，因此，无数的国内外科研人员针对其定量检测这一热点问题进行了诸多的研究。因此，设计专一快捷的谷胱甘肽检测手段具有重要意义。

目前，针对谷胱甘肽等小分子的传统检测方法有比色法［8］、分光光度法［9］、电化学测量［10］、酶催化法［11］以及高效液相色谱法［12］等。这些传统检测手段在谷胱甘肽定量检测方面具备各自的优点，但是这些手段的操作相对复杂，设施成本、要求过高，同时检测的专一性不佳。近些年来，随着荧光探针在小分子检测领域中的不断发展完善，该技术已被逐渐应用于发酵生产中PCR定量检测等领域，并在生物检测行业发挥着重要作用。荧光探针通过与分析物发生特异反应并使其荧光性质发生较大改变而实现对物质的检测，该方法具有操作简单、反应迅速以及专一性强等优点，经过不断地完善，已经被广泛应用于不同类型物质的特异性检测。除了工业与环境检测之外，探针也被逐渐用于检测更为复杂的生物体系。目前的研究证明，对于诸多炎症与癌症，尤其是肝癌等疾病，其病变细胞的谷胱甘肽分泌量往往是正常细胞的数倍，由于谷胱甘肽的定量检测对于病变细胞的诊断具有重要的应用价值，因此，开发出高效且灵敏的谷胱甘肽荧光探针对病理学研究意义十分重大。

1　基于分子内电荷转移机制的荧光探针

分子内电荷转移（intramolecular charge transfer，ICT）是目前最为常见的探针类型。这类荧光探针具有易于制备、信号表达强度高等优点。目前已有诸多ICT探针被用于谷胱甘肽检测。这类探针包含着推拉电子体系，通过识别基团与待分析物的反应改变原本的推拉电子体系，使荧光增强或者波长位移。ICT类探针往往将检测位点与荧光分子直接相连，因此具有设计简单、易于制备、灵敏度高等优点。ICT类荧光探针是最为常规且普遍的探针类型。2013年，Wei等［13］基于香豆素设计出了ICT荧光探针。如图1所示：香豆素7位氨基具有推电子能力，而磺酰胺结构吸电子能力极强，与探针结合后7位供电能力减弱，荧光强度明显下降。随着谷胱甘肽浓度升高，磺酰胺被破坏，使7位推电子能力增强并产生荧光。实验结果表明，探针对谷胱甘肽检测的信号显著、反应迅速、专一性较高，在所检测的多种金属离子与氨基酸中，探针表现出良好的抗干扰性。

2014年，Yin等［14］设计合成了基于菁染料的荧光探针，具有强烈吸电子作用的磺酰胺结构通过哌嗪与荧光分子相连，这一结构对荧光分子的吸电子能力较强，因而造成荧光淬灭。除此之外，该结构也可以作为特异性识别谷胱甘肽的反应位点。当探针与谷胱甘肽反应后，哌嗪结构被谷胱甘肽取代并脱落，造成探针的推拉电子体系改变，荧光增强。该探针有着更好的专一性与敏感性，由于其具有近红外检测的性能，使外界光激发对细胞的破坏大大减少。该探针被成功应用于胞内近红外成像，并进一步被用于小鼠体内进行检测，这对谷胱甘肽在机体内的病理学研究具有十分重大的意义。

2　基于光诱导电子转移机制的荧光探针

近些年来，光诱导电子转移（photoinduced electron transfer，PET）机制已经被广泛用于荧光探针的设计。通常这类探针是由荧光团母体与检测基团通过一定的方式相连，而检测基团在外界光激发下以电子转移的方式使探针母体的荧光淬灭，当与待分析物作用时，检测基团受到破坏使荧光得以复苏。相较于一般的ICT探针，基于PET机制的探针往往能将荧光淬灭完全，能够更大程度地消除背景荧光，因此在检测之后具有更高倍数的荧光增强。PET机制由于其淬灭程度高，往往被应用于OFF-ON型探针的设计。

2014年，Lim［15］合成了菁染料OFF-ON型探针，偶氮联苯作为PET淬灭基团，在处于被光激发的状态下，其电子会自发转移到荧光分子母体，阻碍荧光分子本身的激发态电子向低能级跃迁，并进一步造成荧光淬灭。随着谷胱甘肽加入，偶氮联苯脱落，PET效应被阻断，荧光恢复。该探针具有线粒体靶向性以及近红外检测的优势。随着谷胱甘肽的加入，探针的发射光谱发生明显的红移，且在810 nm处荧光强度不断增强。通过实验发现该探针的检测特异性以及灵敏度均十分良好。

2016年，Pang等［16］利用谷胱甘肽的还原能力，设计了基于硫醇对烯烃还原的谷胱甘肽探针。硝乙烯基通过PET机制对荧光基团母体具有强烈的淬灭作用，同时烯烃结构可特异性识别谷胱甘肽。通过谷胱甘肽与双键发生加成反应，PET效应被阻断，荧光恢复的同时发生波长位移。随着谷胱甘肽加入，发射光谱从480 nm蓝移至420 nm，且强度显著增加。该探针可以有效防止半胱氨酸（cysteine，Cys）与同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）等其他硫醇分子对检测的干扰，特异性良好。

3　基于聚集诱导发光机制的荧光探针

2001年，唐本忠的研究小组［17］发现，一些荧光基团在水溶状态下，可以将外界光能以分子内运动或旋转等途径进行耗散，在这种情况下没有荧光产生。而在高度聚集状态下，由于相互之间位阻效应导致原本的耗散途径受阻，其能量只能以荧光发射的途径发出，这种现象称为聚集诱导发光效应（aggregation induced emission，AIE）。其中，四苯乙烯由于其高荧光量子产率，常被用于AIE探针的母体基团。这类探针是通过检测物与修饰基团的作用，改变其水溶性，从而改变荧光性能，并用作探针进行物质检测。由于荧光物质往往具有苯环等不易溶的刚性结构，在水溶液中具有聚集的趋势，而传统荧光分子在聚集状态下往往会造成荧光信号的大幅度下降甚至淬灭，因此很大程度上限制了其在检测领域的应用。而AIE探针可以避免此类不利因素，相较其他荧光探针具有更好的发光性能。尽管目前关于AIE的探针报道较少，但是其优越的性能为探针的荧光检测提供了新的途径。

2014年，Lou等［18］基于四苯乙烯独特的AIE性能设计了新型谷胱甘肽荧光探针。探针在初始状态下几乎没有荧光发射，当检测基团与谷胱甘肽发生加成反应，导致其溶解性减弱，发生聚集，同时造成荧光增强。经过实验发现，随着谷胱甘肽浓度的升高，探针在520 nm处荧光发射出现了显著的增强。经过与Cys、Hcy以及其他氨基酸的检测结果发现，探针与其他物质几乎不发生反应，探针的专一性良好、抗干扰性强。

4　基于探针共轭结构改变的荧光探针

大多数荧光探针与检测物作用后，会造成修饰基团离去或者改变，探针的基本结构保持不变。而部分探针则通过与谷胱甘肽反应，会较大程度改变探针的基本结构，其原有的共轭体系被大幅度破坏，并转化为新的结构。目前多数针对谷胱甘肽检测的探针往往会受到其他硫醇结构的影响。而该类探针多数基于谷胱甘肽对碳碳双键的特异性还原或者罗丹明开环等原理进行设计，特异性更高，Hcy与Cys等物质对探针的影响往往可忽略不计，具有以往探针不具备的专一性与抗干扰能力，在谷胱甘肽特异性检测方面带来了新的突破。

2014年，Dai等［19］合成了高选择性双光子荧光探针，探针的初始结构几乎不发出荧光信号，其中丙烯酸酯结构可以特异性识别谷胱甘肽，通过与谷胱甘肽结合后丙烯酸酯被破坏，荧光分子开始发出信号。谷胱甘肽的加入可使探针荧光增强27倍，同时该探针具有双光子激发的优势，可以有效检测小牛血清中的谷胱甘肽。探针的灵敏度极高，其检测下限接近纳摩尔级，具备以往探针无法比拟的检测精度。该探针也可以有效区分谷胱甘肽与其他硫醇结构，如Hcy与Cys等。

2014年，Wang等［20］基于罗丹明开环原理设计荧光探针。两侧的间二硝基均作为谷胱甘肽的检测基团。闭环状态下的罗丹明不具备共轭结构，因此不发出荧光，随着谷胱甘肽加入，两侧的检测基团与之作用后被离去，导致探针一系列电子重排并使罗丹明开环，荧光显著增强。由于具备两个检测位点，该探针在快速响应以及高专一性等方面比其他探针有着更为显著的优点，Cys与Hcy等对其干扰几乎可以忽略不计。

2014年，Jiang等［21］设计合成了基于双键还原的谷胱甘肽探针，随着谷胱甘肽的加入，探针的碳碳双键被还原，其原本的共轭结构发生明显改变，导致探针的发射波长从488 nm大幅度蓝移至405 nm。检测结果发现探针的荧光呈现比率变化、抗干扰性强、细胞检测性能优越，可作为比率荧光探针。

5　结论

本文针对各种类型的谷胱甘肽探针进行简要概括，总结了近年谷胱甘肽探针检测的应用以及发展阶段。荧光探针作为一种新型的检测工具，随着多年来的开发被不断完善，已被设计成一种比传统方法更为高效、灵敏以及简便的检测手段，广泛应用于工业发酵及环境监测领域。同时，在生物医学等领域发展尤为迅速，已被用于组织乃至动物体内的谷胱甘肽检测。目前，谷胱甘肽探针除了用于检测病变与肿瘤细胞，也被用作监测抗癌药物缓释的信号分子，在肿瘤诊断方面有着广泛的发展前景。荧光探针有着巨大的发展潜力，经过不断的研究，最终会成为一种被各个领域普遍应用的检测手段。

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（责任编辑：朱小惠）

App lication of fluorescence probes in glutathione detection

ZHU Qing，HE Siyang，DOU Yandong
（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Glutathione，an important active smallmolecule in cells and tissues，is widely used in the field of industrial production and primarily obtained by large-scale fermentation.Therefore，the efficient and specific detection of glutathione has become an important issue in its industrial production and functional studies.As a new kind of detectionmethod，the fluorescent probe has the advantages of high sensitivity，strong specificity and low preparation costand has been widely used in many kinds of smallmolecule detection.In recent years，many fluorescent probes used to detect glutathione had been reported and showed good detection performance.This paper summarized the different kinds of glutathione probes and theirmechanismswere also briefly introduced.

glutathione；fluorescent probe；specific detection

O64

A

1674-2214（2016）03-0170-05

2016-05-16

新型近红外水解酶FRET探针设计、制备及可视化研究（21272212）

朱（1970—），浙江义乌人，教授，博士，研究方向为化学生物学，E-mail：zhuq@zjut.edu.cn.