桑椹果酒酵母GP2的发酵条件研究

左勇，杨小龙，傅彬，叶碧霞，张晶（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）



桑椹果酒酵母GP2的发酵条件研究

左勇，杨小龙，傅彬，叶碧霞，张晶
（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

以桑椹果园土壤为分离源分离筛选桑椹果酒酵母，得到一株具有产香效果好，起酵快等优点的酵母菌，最终将其命名为GP2。在单因素试验基础上，通过正交试验和方差分析，确定最佳发酵条件为：发酵温度26℃，SO2添加量为80 mg/L，糖添加量220g/L，接种量为0.9%。

桑椹果酒；酵母菌；单因素试验；正交试验；方差分析

桑椹又称桑果，大多种类的桑果呈暗紫色，少数成乳白色。桑椹味美，深受人们的喜爱，享有“中华果王”之美誉［1］。桑椹含有种类丰富的有机酸，维生素以及人体缺少的矿物质和微量元素，具有补肝益肾，补血养颜，改善生殖亚健康之功效。现代医学研究表明，桑椹能阻断体内有害物质的生成，提高酶的活性，增强抵抗力［2］。

桑椹是一种极易腐烂的水果，到了收获季节，大量囤积的桑椹由于不能及时销售，就容易浪费掉，将新鲜的桑椹酿造成易保存的桑椹果酒，不但能提高桑椹带来的经济效益，还能满足市场对果酒的需求。目前，大多数果酒酿造多采用葡萄酒酿酒酵母进行发酵，由于葡萄汁和桑椹果汁成分有显著的差异［3］，以葡萄酒酿酒酵母酿出的桑椹果酒口感欠佳在所难免，缺乏自身特色。因此，采用适合酿造桑椹果酒的高专用酵母进行桑椹果酒酿造，是解决这一课题的关键。当前，不少科技工作者在从事桑椹果酒酵母的筛选及发酵条件的研究，由于切入点不同，所筛选出的酵母也不统一。

本试验以产香、产酒率以及起酵速度为出发点，筛选获得了一株适用于发酵桑椹的酿酒酵母GP2，并从发酵温度，SO2添加量，糖添加量和菌株接种量对酵母菌GP2的发酵条件进行了研究。

1　材料与方法

1.1材料

桑椹：购于内江市威远县；一级白砂糖：购于超市；菌种GP2：四川理工学院微生物实验室筛选所得；对照菌为安琪酿酒高活性干酵母：安琪酵母伊犁有限公司。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂及培养基

活力大于等于500 000 U/g果胶酶（生化试剂）、硫酸钠（分析纯）、柠檬酸（分析纯）、糖（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；虎红琼脂（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；富集培养基：葡萄糖5%、KH2PO40.25%、尿素0.1%、酵母膏0.05%、MgSO40.1%、Fe2（SO4）30.01%、孟加拉红（1%的水溶液）0.023%，121℃高压灭菌15 min。

PDA培养基：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、水1 000 mL、自然pH。

1.2.2仪器

恒温恒湿箱HL MJ-250：上海雷韵试验仪器制造有限公司；电子天平AR1140：奥豪斯公司；可调温电炉TW-2000W：成都市永兴电器厂；立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；酸度计PHS-3C：奥豪斯仪器（上海）有限公司；手持糖度计：成都格纳丝商贸有限公司；酒精计预制27000005-1：沈丘北郊玻璃仪器厂；榨汁机JYL-350：山东九阳小家电有限公司；光学显微镜XSP-1600X：广州新怡光学显微镜厂家。

1.3方法

1.3.1工艺流程［4］

桑椹果实→选果→洗果→破碎打浆→成分调整（SO2，白砂糖，接种）→主发酵→分离→后发酵→初滤→调整→陈酿→澄清→精滤→装瓶→杀菌

1.3.2单因素试验

影响果酒发酵的因素很多，本试验主要从温度、糖添加量、SO2添加量以及接种量4个方面考虑。温度选择范围：22℃到30℃之间，设置5个梯度。糖添加量：60 g/L到220 g/L，设置5个梯度。SO2添加量：40 mg/L到120 mg/L之间，设置5个梯度。接种量：0.5%到1.3%之间，设置5个梯度。通过单因素试验确定适宜的发酵温度，糖添加量，SO2添加量以及接种量。

1.3.3正交试验

在单因素试验基础上，确定适宜的发酵温度，SO2（亚硫酸钠折算后）添加量，白砂糖添加量，接种量，根据这四因素设计L9（34）正交试验。

1.4分析测定方法［5］

酒精度：酒精计测定；糖度：手持糖量计测定；残糖：斐林滴定法测定（测定时将酒样稀释10倍可有效降低色素干扰）；酸度：pH计测定；感官评分：结合葡萄酒评分标准以及桑椹果酒实际，制定感官评分标准见表1。

表1　桑椹果酒的评分标准［2-6］Table 1　The scoring criteria of mulberry wine

2　结果与分析

2.1单因素试验［7］

2.1.1温度对发酵结果的影响

在装有300 mL桑椹果浆的5个锥形瓶中加入白砂糖140 g/L、添加SO260 mg/L，酵母菌GP2接入量为0.7%，然后发酵温度分别在22、24、26、28、30℃条件下发酵8 d，结果如图1。

图1　不同温度对发酵结果的影响Fig.1　The effects of different temperature for fermentation results

由图1可知，酵母菌GP2在26℃时产酒量最高，残糖量最低，而温度较低或较高时酒精度不高，原因在于温度太低或过高，会抑制酵母菌的生长繁殖及发酵，影响糖转化为酒精，因此26℃为酵母菌GP2较适宜的发酵温度。在后续的正交试验中，发酵温度选择在26℃附近进行。

2.1.2SO2添加量对发酵结果的影响

在装有300 mL桑椹果浆的5个锥形瓶中添加白砂糖140 g/L，酵母菌GP2接入量为0.7%，SO2添加量分别为40、60、80、100、120 mg/L，在26℃条件下发酵8 d，结果如图2。

图2　不同SO2添加量对发酵结果的影响Fig.2　The effects of different amounts of SO2for fermentation results

添加适当的SO2量，可有效的抑制发酵过程中杂菌的生长，使得酿酒酵母在发酵过程中占主体优势。由图2可知，当SO2的添加量高于或低于60 mg/L都会使产酒率下降，原因在于，SO2添加量过低，杂菌会在其中生长，将消耗部分糖类物质，从而影响酒精含量；SO2添加量过高，将抑制到酿酒酵母自身的生长繁殖，从而也会影响到酒精度和残糖含量。在后续的正交试验中，SO2添加量选择在60 mg/L左右。

2.1.3糖添加量对发酵结果的影响

在装有300mL桑椹果浆的5个锥形瓶中添加白砂糖分别为60、100、140、180、220g/L，添加SO2（60mg/L），再接入0.7%酵母菌GP2，在26℃条件下发酵8 d，结果如图3。

图3　不同白砂糖添加量对发酵结果的影响Fig.3　The effects of different amounts of sugar for fermentation results

桑椹含有一定的糖分，但含量不高，若只用桑椹自身的含糖进行发酵，酒精度较低，所以选择在发酵过程中添加一定量的糖分。由图3可知，当糖添加量为180 g/L时酒精度达到一个稳定值，当添加量超过这一值时酒精度没有什么显著变化，但这一过程中残糖含量是随着糖添加量的增加而增加的。所以在后续的正交试验试验中为提高糖利用率，白砂糖的量选择在180 g/L附近。

2.1.4酵母菌GP2接种量对发酵结果的影响

在装有300 mL桑椹果浆的5个锥形瓶中添加白砂糖的量为140 g/L，SO2添加量为60 mg/L，酵母菌GP2接种量分别为0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%，在26℃条件下发酵8 d，结果如图4。

图4　不同酵母接种量对发酵结果的影响Fig.4　The effects of different amounts of yeast for fermentation results

由于酵母菌的接种量可直接影响起酵和发酵速度，采用较大的接种量可以缩短发酵周期。由图4可以出，当酵母菌GP2接种量为0.9%时，酒精度产量较高。从整体上看，酵母菌的接种量达到0.9%以上后，对酒精度和残糖的影响并不是很大。在后续的正交试验中，酵母菌GP2接种量选择为0.9%左右。

2.2正交试验结果

根据单因素的试验结果，设计以发酵温度、SO2添加量、糖添加量、接种量为主要因素的正交试验，正交因素试验水平表见表2。正交试验结果及方差分析分别见表3和表4。

表2　L9（34）正交试验因素水平表Table 2　The level form of orthogonal test factors

表3　正交试验结果Table 3　The results of orthogonal test

表4　方差分析Table 4　The analysis of variance

表3中，酒精度权重［8］取30，感官评定权重取70。根据正交试验结果分析可知，在4个影响因素中，加糖量影响最大，其次是发酵温度，再次是接种量，最后是SO2的添加量。由方差分析表4可知，糖添加量和发酵温度对桑椹果酒的发酵有显著的影响，而接种量和SO2添加量影响较弱，最后确定最佳组合为A2B3C3D2，即发酵温度26℃，SO2添加量为80 mg/L，糖添加量220 g/L，接种量为0.9%。

2.3验证试验［9］

对确定的组合A2B3C3D2进行试验验证，重复3次。最终的试验结果均优于正交试验中其他组，其酒精度平均值为10.7%vol，达到了果酒的酒精度一般在7%vol～13%vol之间的指标［10］。感官评分平均分87，证明正交试验得出的最佳工艺条件是稳定可靠的，在最优条件下，最终发酵结果与安琪酿酒酵母相比，除酒精度略低于安琪酿酒酵母（安琪酿酒酵母发酵后酒精度为10.9%vol）外，其余感官指标与安琪酿酒酵母差别不大，在桑椹果酒芳香味方面GP2发酵结果更为突出。

3　结论

本研究从发酵温度，SO2添加量，糖浓度，酵母接种量4个方面对酵母菌GP2发酵条件进行了单因素试验和正交试验，并通过方差分析，确定了桑椹果酒酵母GP2的最佳发酵条件为：发酵温度26℃，SO2添加量为80 mg/L，糖添加量220 g/L，接种量为0.9%。从最终的发酵结果看，酵母菌GP2适合桑椹果酒产业化应用，可以替代传统葡萄酒酵母进行的桑椹果酒发酵。

［1］陈祖满.桑椹果酒加工工艺的研究［J］.酿酒，2005，32（2）:73-75

［2］杜琨.桑椹果酒的研制［J］.食品工业，2010（6）:29-30

［3］赵祥杰，杨荣玲，涂国全，等.桑椹果酒专用酵母的诱变选育研究［J］.酿酒科技，2006（12）:29-36

［4］左勇，李杨，祁峰，等.桑椹酒发酵工艺条件的研究［J］.酿酒科技，2013（11）:62-64

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［6］潘训海，刘新露.桑椹果酒酵母的分离及筛选［J］.江苏农业科学，2013，41（5）:249-251

［7］李加兴，陈双平，梁先长，等.猕猴桃干型果酒发酵工艺优化［J］.食品科学，2010，31（22）:504-507

［8］潘丽军，陈锦权.试验设计与数据处理［M］.南京:东南大学出版社，2008:100-126

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Studies on Fermentation Conditions of the Yeast GP2 for Mulberry Wine

ZUO Yong，YANG Xiao-long，FU Bin，YE Bi-xia，ZHANG Jing
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

A yeast strain for mulberry wine was isolated and screened from mulberry orchard soil，and this strain has advantages of effectively producing fragrance and rapid fermentation.Eventually，it was named as yeast strain GP2.The optimal conditions were determined on the base of single factor experiments，orthogonal tests and variance analysis，the results as follows：26℃fermentation temperature，SO280 mg/L，sucrose 220 g/L and inoculation 0.9%.

mulberry wine；yeast；single factor experiments；orthogonal tests；variance analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.022

2015四川省重大成果转化项目（2014年获四川省科技进步二等奖）

左勇（1972—），男（汉），教授，硕士，研究方向：发酵食品。

2015-06-28