超声辅助多菌种发酵制备葛根酵素的研究

王振斌，刘加友，严贤，陈兵兵（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）



超声辅助多菌种发酵制备葛根酵素的研究

王振斌，刘加友，严贤，陈兵兵
（江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013）

以葛根为原料，植物乳杆菌和酿酒酵母为发酵菌种，在考察超声时间、超声强度和发酵液pH对发酵菌种产蛋白酶和脂肪酶影响的基础上，利用响应面优化超声波促进多菌种发酵制备葛根酵素的最佳工艺。试验结果表明超声波促进多菌种混菌发酵制备葛根酵素的最佳条件为：pH为4.87，超声时间82.95 min，超声强度0.14 W/cm3时，葛根酵素的蛋白酶和脂肪酶分别达到55.32 U/mL和125.9 U/mL，经试验验证，在此条件下的蛋白酶、脂肪酶酶活与预测值接近。本文旨在为超声促进发酵制备葛根酵素饮料提供理论支撑，也为酵素饮品的酶活指标提供参考。

超声；发酵；酵素；葛根

葛根为豆科葛属（Pueraria D.C.）植物，既是传统的中药又是保健食品［1］。据报道葛根中含有超过70种功能性化合物，营养丰富，特别是葛根中的黄酮等三萜类化合物，在改善心脑血管循环、降低心肌耗氧量、降低血糖、防止高血压及动脉硬化、抗炎、祛痰、解热、提高机体免疫力、抗菌和抗病毒等具有多种药理作用［2-5］。利用植物乳杆菌和酵母菌发酵葛根液，一方面能够保留葛根原本的营养物质，另一方面还能提高葛根黄酮的提取率，符合葛根黄酮提取工艺的发展趋势，最重要的是植物乳杆菌和酵母菌发酵还能产生蛋白酶和脂肪酶等代谢产物，制备一种新型保健饮料—酵素，同时也为酵素饮品中脂肪酶和蛋白酶指标的定义提供理论参考。

酵素是一种以乳酸菌、酵母菌等益生菌发酵果品、蔬菜而形成的一种富含脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶以及乳酸、醋酸及少量乙醇等营养成分的液体或固体食品，具有消炎抗菌、抗氧化、解酒护肝、美白和改善肠道微环境的作用［6-9］，由于目前传统的酵素生产周期较长、价格昂贵，因此缩短酵素发酵时间，降低酵素产品价格的研究需要迫切开展。

超声波是指频率大于20 kHz、频率低而能量高的功率型超声波，具有热效应、空化效应、机械效应和生物效应［10］。张元标等［11］用18 kHz，3 W的超声波辐照海水小球藻，其生长速率可为对照组的1.86～2.26倍，脂肪酸不饱度亦比对照组提高7.7%～12.5%。研究还发现微生物细胞在适宜强度的超声作用下也会加快生长速度。高大维等［12］采用低强度超声辐照对数生长期的啤酒酵母细胞，细胞生长速率提高，细胞干重也有所增加，说明超声波对啤酒酵母细胞有促进生长的作用，因此本文基于上述研究，在单因素的基础上，采用响应面优化超声技术促进植物乳杆菌和酵母菌来发酵制备葛根酵素的工艺参数，为超声波技术在促进葛根酵素发酵中的应用提供参考。

1　材料和方法

1.1材料及试剂

葛根：来自句容茅宝葛业有限公司；酿酒酵母：购买于安琪酵母公司；乳酸菌：来自于江苏大学食品学院实验室分离的植物乳杆菌；福林酚试剂：来自于国药试剂自制；琥珀酸二辛酯磺酸钠、异辛烷、三油酸甘油酯、油酸、吡啶、苯、醋酸铜、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等：均是分析纯，来自国药集团的化学试剂有限公司；MRS培养基：蛋白胨10 g、酵母浸膏5 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、柠檬酸二铵2 g、乙酸钠5 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、吐温-80 1 mL，琼脂15 g～20 g，溶解于1 000 mL水中，调节pH值至6.2～6.4，115℃灭菌25 min。

1.2试验仪器

HH-A恒温水浴搅拌器：江苏金坛市中大仪器厂；UV1000可见光分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；TGL-16M高速离心机：湘仪离心机仪器有限公司；W-CJ-1F超净工作台：苏净集团安泰公司；脉冲多频扫描超声仪：无锡市上佳生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1葛根的处理

将葛根丁60℃的热风烘干，60目粉碎，将葛根粉与蒸馏水按照料液比1∶15（g/mL）混合均匀，煮沸糖化1.5 h，加入50 g红糖，30 g蜂蜜，离心取上清液，调节发酵液的pH，均分放入5个1 L锥形瓶中，灭菌，备用。

1.3.2菌种的活化

乳酸菌的活化：活化菌种在MRS液体培养基中进行，32℃培养箱中传代2次～3次，使菌种数量达到109CFU/mL，然后加入发酵液体积的3%。

酵母菌的活化：将活性干酵母加入到2%的葡萄糖，在30℃的条件下进行活化3 h～5 h，然后加入发酵液体积的3%。

乳酸菌菌落数根据平板计数法，参照GB 4789.35-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》；酵母菌的计数参考文献［13］。

1.3.3粗酶液的分离与蛋白酶、脂肪酶酶活的测定

将发酵好的发酵液在4℃下，5 000 r/min离心20 min，取其上清液即为粗酶液。

蛋白酶酶活的测定方法参考文献［14］。蛋白酶酶活定义：40℃1 min水解酪蛋白产生1 μg酪蛋白定义为一个蛋白酶活力单位（U）。

脂肪酶酶活的测定方法参考文献［15］。脂肪酶定义：30℃1 min内产生1 μmol油酸所需的脂肪酶量为一个活力单位（U）。

1.3.4pH、超声时间、超声强度对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶和脂肪酶的影响

1）pH对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶和脂肪酶的影响

按照1.3.1的方法制备葛根发酵液，分别调节pH至4.5、5.0、5.5、6.0后各接入发酵液3%的乳酸菌和酵母菌，在32℃下培养发酵，分别在26、34、58、82、106 h考察初始pH对菌种产蛋白酶和脂肪酶的影响。

2）超声时间对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶和脂肪酶的影响

按照1.3.1的方法制备葛根发酵液，各接入发酵液3%的乳酸菌和酵母菌，然后分别在超声30、60、90、120 min，在32℃下培养发酵，分别在26、34、58、82、106 h考察初始pH对菌种产蛋白酶和脂肪酶的影响。

3）超声强度对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶和脂肪酶的影响

按照1.3.1的方法制备葛根发酵液，各接入发酵液3%的乳酸菌和酵母菌，然后分别超声30、60、90、120min，在32℃下培养发酵，分别在26、34、58、82、106 h考察初始pH对菌种产蛋白酶和脂肪酶的影响。

1.3.5超声促进乳酸菌、酵母菌发酵条件的优化

本试验采用Box-Bohnken中心组合试验设计，根据单因素试验结果分析确定因素水平，以蛋白酶酶活、脂肪酶酶活为响应值，设计三因素三水平的响应面分析（Response surface methodology，RSM）试验。试验以随机次序进行，重复两次，采用Design-Expert软件进行响应面分析优化乳酸菌、酵母菌发酵条件，响应面因素与水平表见表1。

表1　因素水平表Table 1　Factor levels table

2　结果与分析

2.1pH对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶和脂肪酶的影响

pH对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶和脂肪酶的影响见图1。

图1　pH对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶的影响Fig.1　The influence of pH on lactic acid bacteria and yeast to produce protease

由图1可知，初始pH对乳酸菌和酵母菌产蛋白酶酶活影响显著。当pH为4.5时，乳酸菌、酵母菌产生的酶活活性较低。当pH为5.0时，蛋白酶酶活达到最强；然后随着pH的增大，蛋白酶酶活呈现降低趋势，分析原因可能是发酵液中的乳酸菌为优势菌群，抑制了酵母菌的生长。随着发酵时间的延长，蛋白酶酶活趋向稳定，原因可能是发酵进程结束，没有可利用的还原糖供乳酸菌和酵母菌利用。

pH对乳酸菌、酵母菌产脂肪酶的影响见图2。

图2　pH对乳酸菌、酵母菌产脂肪酶的影响Fig.2　The influence of pH on lactic acid bacteria and yeast to produce lipase

由图2可知，初始pH对乳酸菌和酵母菌产脂肪酶酶活具有显著影响。在发酵26 h时，此时的脂肪酶酶活没有较大差异，随着发酵的进行，此时的脂肪酶酶活呈现上升的趋势，当初始pH为5.0时，发酵时间58 h，此时的脂肪酶酶活最大。

2.2超声时间对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶和脂肪酶的影响

超声时间对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶的影响见图3。

图3　超声时间对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶的影响Fig.3　The influence of ultrasonic time on lactic acid bacteria and yeast to produce protease

由图3可知，超声时间对乳酸菌和酵母菌产蛋白酶影响显著。在发酵初期施加90 min的超声，发酵26 h时，乳酸菌和酵母菌产蛋白酶酶活上升趋势明显，与其他超声组相比，蛋白酶酶的活性明显高于其他组。

超声时间对乳酸菌、酵母菌产脂肪酶的影响见图4。

图4　超声时间对乳酸菌、酵母菌产脂肪酶的影响Fig.4　The influence of ultrasonic time on lactic acid bacteria and yeast to produce lipase on lipase

由图4可知，超声时间对脂肪酶酶活的影响显著。在发酵前期分别施加不同时间的超声，施加超声组的脂肪酶活除超声120 min外不仅明显高于空白组，而且提前达到最大酶活。

2.3超声强度对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶和脂肪酶的影响

超声强度对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶的影响见图5。

由图5可知施加不同强度的超声波对乳酸菌和酵母菌产蛋白酶有明显作用。当施加0.05、0.10、0.20 W/cm3的超声密度时，蛋白酶酶活在58 h达到最大；特别是施加0.15 W/cm3的超声密度组，蛋白酶酶活显著高于其他组，特别是空白组。

超声强度对乳酸菌、酵母菌产脂肪酶的影响见图6。

图5　超声强度对乳酸菌、酵母菌产蛋白酶的影响Fig.5　The influence of ultrasonic intensity on lactic acid bacteria and yeast to produce protease

图6　超声强度对乳酸菌、酵母菌产脂肪酶的影响Fig.6　The influence of ultrasonic intensity on lactic acid bacteria and yeast to produce lipase

由图6可以看出施加不同强度的超声波对乳酸菌和酵母菌产脂肪酶作用显著。当施加0.20 W/cm3的超声密度时，超声波明显抑制了乳酸菌和酵母菌，但随着发酵的进行，脂肪酶酶活增加显著。由于其他超声组施加的超声强度较小，没有对乳酸菌和酵母菌产生较大的影响，脂肪酶酶活随着发酵的进行呈现增大趋势，特别是施加0.15 W/cm3的超声组，脂肪酶酶活明显高于其他组。

2.4超声促进乳酸菌和酵母菌发酵的响应面优化

基于单因素试验结果分析，以蛋白酶和脂肪酶酶活为响应值，采用RSM法来寻求超声促进乳酸菌和酵母菌发酵的最优工艺参数。Box-Behnken试验设计及结果见表2，并利用Design Expert对响应面试验结果进行方差分析。

表2　响应面设计方案和试验结果Table 2　The response surface design scheme and test results

表3　方差分析Table 3　Analysis of variance

各因素经二次多项回归拟合后，分别得到Y1、Y2与pH、超声时间、超声强度3个因素的二次多项回归方程为：

Y1=54.59-1.43X2-1.64X3+2.4X1X2-1.76X2X3-2.88 X12-3.81X22-4.04X32

Y2=120.71-5.86X3+5.52X1X2-6.95X2X3-7.31X22-7.04X32

从表3的方差分析结果可以看出，模型显著，回归模型可以用来拟合3个因素对乳酸菌和酵母菌产蛋白酶和脂肪酶的影响。回归方程与实际数据之间具有良好的拟合性。从因素X1、X2、X3对蛋白酶和脂肪酶的影响来看，Y1方程的一次项X2、X3，二次项X12、X22、X32，交互项X1X2和X2X3均显著。Y2方程的一次项X3，二次项X22、X32，交互项X1X2和X2X3均显著，这说明响应值的变化十分复杂，试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是呈二次关系。

根据回归方程，利用Design Expert作因子间的响应面分析图。如图7、图8、图9、图10所示，直观地反应了最为显著的pH与超声时间、超声时间与超声强度之间的交互作用对乳酸菌和酵母菌所产蛋白酶和脂肪酶酶活的影响。

图7　pH和超声时间交互作用对蛋白酶酶活的响应面图及等高线图Fig.7　Response surface and contour plot of pH and ultrasonic time interaction of protease enzyme activity

图8　超声时间和超声强度交互作用对蛋白酶酶活的响应面图及等高线图Fig.8　Response surface and contour plot of ultrasonic time and ultrasonic intensity interaction of protease enzyme activity

图9　pH和超声时间交互作用对脂肪酶酶活的响应面图及等高线图Fig.9　Response surface and contour plot of pH and ultrasonic time interaction of lipase enzyme activity

图10　超声时间和超声强度交互作用对脂肪酶酶活的响应面图及等高线图Fig.10　Response surface and contour plot of ultrasonic time and ultrasonic intensity interaction of lipase enzyme activity

通过分析计算得到超声促进乳酸菌和酵母菌发酵最优条件为：pH为4.87，超声时间82.95 min，超声强度0.14 W/cm3。此条件下，蛋白酶和脂肪酶发酵的最大酶活为为55.32 U/mL和125.90 U/mL。

2.5验证试验

为表明响应面模型的合适性和有效性，进行验证试验。在pH为4.87，超声时间82.95 min，超声强度0.14 W/cm3，重复3次，蛋白酶和脂肪酶发酵的最大酶活为为（55.32±3.52）U/mL和（125.90±4.12）U/mL，接近模型预测值。

3　结论

以葛根为原料，植物乳杆菌和酿酒酵母为发酵菌种，在pH为4.87，超声时间82.95 min，超声强度0.14 W/cm3时，葛根酵素的蛋白酶和脂肪酶分别达到55.32 U/mL和125.9 U/mL。结果不仅证实可以利用葛根作为原料来生产植物酵素，而且还为葛根酵素酶活标准的制定提供参考。

［1］谭小燕，李达斌，中翔渝，等.东北山区野葛中葛粉与总黄酮含量动态变化研究［J］.中国医药导报，2014，11（6）:87-89

［2］Wong K H，Li G Q，Li K M，et al.Kudzu root:Traditional uses and potential medicinal benefits in diabetes［J］.Journal of Ethnopharmacology，2011，134（3）:584-607

［3］Rakin M，Vukasinovic M，Siler-Marinkovic S，et al.Contribution of lactic acid fermentation to improved nutritive quality vegetable juices enriched with brewer’s yeast autolysate［J］.Food Chemistry，2007，100（2）:599-602

［4］ZhangGuangcheng.AntioxidantisoflavonesKudzu［J］.Chinese herbal medicines，1997，20（7）:358-359

［5］Zhang Baonian，Cui Weidong.Affect only the kidney tissue ANGⅡantihypertensive effect of puerarin on renal hypertensive rats［J］. Chinese Medicine and Clinical Pharmacology，2010，20（2）:26-28

［6］董银卯，于晓艳，潘妍，等.微生物酵素抑菌功效研究［J］.香料香精化妆品，2008（4）:27-29

［7］蒋增良，毛建卫，黄俊，等.葡萄酵素在天然发酵过程中体外抗氧化性能的变化［J］.中国食品学报，2014，14（10）:29-34

［8］曲佳乐，赵金凤，皮子凤，等.植物酵素解酒护肝保健功能研究［J］.食品科技，2013，38（9）:51-54

［9］任清，于晓艳，潘妍，等.微生物酵素美白抗衰老功效研究［J］.香料香精化妆品，2008，6（4）:28-32

［10］罗登林，丘泰球，卢群.超声波技术及应用［J］.日用化学工业，2005，35（5）:323-326

［11］张元标，李文权，王清池，等.超声辐射对海水小球藻的生物效应［J］.厦门大学学报，2001，40（3）:653-656

［12］高大维，雷德柱，高文宏，等.多波形超声波辐照对啤酒酵母细胞生长的影响［J］.华南理工大学学报，2000，28（7）:36-39

［13］明儒成，封新平.食品中酵母菌计数检验方法的改进［J］.中国卫生检验杂志，2007，17（3）:478-491

［14］Liu Chuan-bin，Liu Yan，Liao Wei，et al.Application of statistically based experimengtal designs for the optimization of nisin production from whey［J］.Biotechnology Letters，2003，25（11）:877-882

［15］黄锡荣，张文娟，宋少芳.分光光度法测定微乳液中脂肪酶的酶活［J］.化学通报，2001（10）:659-661

The Research on Preparation of Kudzu Ferment by Mixed Bacteria with Ultrasonic Wave

WANG Zhen-bin，LIU Jia-you，YAN Xian，CHEN Bing-bing
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China）

The kudzu and lactobacillus plantarum，saccharomyces cerevisiae were taken as material and pzymocyt respectivity.On the base of the effect of ultrasonic time，ultrasonic intensity and initial pH on protease and lipase activity，reponse surface was applicated in the optimizing process of preparation of kudzu ferment by mixed bacteria with ultrasonic wave.The results were showed that：pH 4.87，ultrasonic time 82.95 min，ultrasonic intensity 0.14 W/cm3，the protease and lipase activity were arrived at 55.32 U/mL and 125.9 U/mL.After the verification test，protease and lipase activity were closed to the predictive value.The paper was offered not merely theoretical support but also enzyme activity reference for ferment preparation.

ultrasonic wave；fermentation；ferment；kudzu

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.038

江苏镇江市科技支撑计划（No.NY2012013；GY2012021）；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）；江苏大学研究生科研创新项目（No.KYXX0047）

王振斌（1975—），男（汉），教授，硕士生导师，研究方向：发酵食品加工、功能食品加工。

2015-07-03