不同地区粘豆包酸面团中微生物多样性分析

陶东娅，金银旗（.台州职业技术学院机电工程学院，浙江台州38000；.台州市光跃饮水设备有限公司，浙江台州3800）



不同地区粘豆包酸面团中微生物多样性分析

陶东娅1，金银旗2
（1.台州职业技术学院机电工程学院，浙江台州318000；2.台州市光跃饮水设备有限公司，浙江台州318020）

本研究以采集自黑龙江不同县的粘豆包酸面团为研究对象，利用变性梯度凝胶电泳和基因测序技术对上述样品中的细菌和真菌的多样性进行揭示。结果表明：在4种样品中细菌的多样性高于真菌，并发现了7种不同的细菌菌种，4个不同的真菌菌种，其中以乳杆菌属中的微生物最为丰富。通过不同地区样品多样性的比较发现：粘豆包酸面团中微生物的多样性与收集地之间存在一定的联系。

粘豆包酸面团；微生物多样性；变形梯度凝胶电泳；基因测序

传统粘豆包是利用自然环境中天然野菌种进行发酵后包裹红豆馅蒸制而成的冷冻类传统自然发酵食品，产品色泽亮黄、粘稠筋道、营养丰富，且矿物质等能在酸化过程中被充分的吸收利用［1-2］。在粘豆包的制作过程中，粘豆包酸面团的自然发酵是最重要的环节之一，同时正是因为要依靠天然发酵，所以粘豆包酸面团的风味和品质具有很强的地域特色［3-4］。

粘豆包酸面团的自然发酵主要是细菌和真菌的发酵，杨健等对黑龙江省肇州县的粘豆包酸面团进行了细菌多样性的研究，初步揭示了其细菌的多样性［5］。Tingtao Chen等研究了不同原料和配比对粘豆包酸面团中微生物组成的影响，发现相比单一谷物的酸面团，混合配比的酸面团的微生物多样性更为丰富，且主要的菌属为乳酸菌和酵母菌［6］。本研究在上述研究的基础上，采集了黑龙江省不同地区的粘豆包酸面团（大黄米面∶玉米面=3∶1，质量比），对其进行了细菌和真菌的多样性分析，以期全面揭示黑龙江地区粘豆包酸面团微生物的组成结构，并阐述粘豆包酸面团微生物多样性与地域之间的关系，为开发工业化的粘豆包发酵剂提供理论参考。

1　材料与仪器

1.1主要材料

1.1.1样品来源

本试验采用的粘豆包酸面团均采购自不同地区的农民家庭，这些地区分别为：黑龙江省牡丹江市东宁县、黑龙江省哈尔滨市宾县、黑龙江省双鸭山市宝清县和黑龙江省绥化市青冈县，这些样品的主要原料均为大黄米面和玉米面，比例均为3∶1（质量比），并分别编码为样品A、B、C和D。

1.1.2主要试剂

细菌全基因组DNA提取试剂盒、真菌DNA提取试剂盒、2×Taq PCR Master Mix（含染料）、D2000，上述生物试剂均购买自北京天根生化科技有限公司；无水乙醇：山东紫翔化工销售有限公司；琼脂糖：南京生兴生物；丙烯酰胺：济南智恒致远化工科技有限公司；双丙烯酰胺：济南智恒致远化工科技有限公司；冰醋酸：保定市百运化工有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）：保定市百运化工有限公司；尿素：保定市百运化工有限公司；去离子甲酰胺：上海酶联生物研究所；四甲基乙二胺（TEMED）：上海博谷生物；过硫酸铵：济南世纪通达化工有限公司；硝酸银：广州市鑫铂化工有限公司；甲醛：青州市恒兴化工有限公司。

1.2试验仪器

TCL16G离心机：上海姚氏仪器设备厂；PL203型电子分析天平：上海仪电科学仪器股份有限公司；水浴锅：上海仪电科学仪器股份有限公司；DYY-10C型电泳仪：北京市六一仪器厂；变性梯度凝胶（DGGE）电泳仪：美国Bio-Rad公司。

2　方法

2.1样品DNA的提取

根据杨健等［5］的报道制备粘豆包酸面团的悬浮液，之后按照细菌DNA提取试剂盒和真菌提取试剂盒说明书提取样品中细菌和真菌的DNA。

2.2DNA的PCR扩增

以样品细菌的DNA为模板，引物采用细菌16S rRNA V3区引物BA338f-GC和UN518r，引物序列和扩增条件如费鹏等的报道［7］。以样品真菌DNA为模板，引物采用真菌26S rRNA D1/D2区引物NL1-GC和LS2，引物序列和扩增条件如姚笛等的报道［8］。

2.3变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析

细菌DNA扩增的DGGE分析采用35%～60%的变性凝胶梯度电泳，上样量为30 μL、反应温度为60℃、电压130 V、电泳8 h；真菌DNA扩增的DGGE分析采用35%～70%的变性梯度，上样量为30 μL、反应温度为60℃、电压120 V、电泳9 h。电泳后将DGGE胶用去离子水清洗，之后采用张巧云等［9］的方法对胶体进行银染，并用相机进行拍照。

2.4基因测序分析

对胶体中的条带进行切胶，并用清水进行清洗，捣碎，加入50 μL去离子水，在4℃冰箱过夜，以上清液为模板，采用没有GC夹的引物进行PCR扩增，之后将PCR产物送往苏州金唯智生物科技有限公司进行测序分析。将基因测序结果在GENBANK数据库中进行Blast比对，对菌株进行定性分析。

3　结果与分析

3.1粘豆包酸面团DNA样品PCR扩增

用1%的琼脂糖凝胶电泳分别对粘豆包酸面团细菌DNA扩增产物和真菌DNA扩增产物进行检验，结果如图1所示。

图1　不同地区样品DNA扩增产物Fig.1　Amplification product of DNA of samples from different region

图1（a）中，4个样品的细菌DNA PCR扩增产物的目的条带都在200 bp左右，条带清晰均一，可以认定细菌16S rRNA V3区的PCR产物。图1（b）中，4个样品的真菌DNA PCR扩增产物的目的条带都在250 bp左右，条带清晰均一，可认定为真菌26S rRNA D1/D2区的目的条带。因此上述PCR产物均可用于后续的DGGE分析。

3.2不同地区粘豆包酸面团细菌多样性分析

利用DGGE电泳技术分析不同地区粘豆包酸面团中细菌的多样性，结果如图2所示。

在4个样品中共发现了7个不同位置的条带，这说明在粘豆包酸面团中细菌的多样性较为丰富，且4个来自不同地区的样品中细菌多样性也存在着一定差异。此外，样品B（哈尔滨市宾县）和样品D（绥化市青冈县）的DGGE图谱比较接近，这两个样品分别来自哈尔滨市宾县和绥化市的青冈县，样品C（双鸭山市宝清县）的DGGE图谱与其他3个样品有明显的差距，这可能是因为粘豆包酸面团是天然发酵的食品，其中的微生物组成与地域有一定的联系，在地理位置上样品B和样品D比较接近，而样品C在地理位置上远离其他3个样品。

图2　不同地区样品细菌DGGE图谱Fig.2　DGGE profile of the bacteria of DNA of samples from different regions

将7个不同的条带进行胶回收、PCR扩增和基因测序，测序结果如表1所示。

表1　不同地区样品细菌和真菌DGGE图谱中条带Blast对比结果Table 1　Blast result of bands in DGGE profiles of bacteria and fungi of samples from different regions

7个条带代表了7个不同的菌种，分别为：植物乳杆菌（Lactococcus fermentum）、柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum）、罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）、食窦魏斯氏菌（Weissella.cibaria）、乳酸乳球菌（L.lactis）、短乳杆菌（L.brevis）和融合魏斯氏菌（Weissella confusa），其中代表植物乳杆菌、柠檬明串珠菌和短乳杆菌的条带虽然亮度不一，但是这些菌都出现了4个粘豆包酸面团样品中。罗伊氏乳杆菌和食窦魏斯氏菌只出现在了样品B和样品C中，融合魏斯氏菌只出现在了样品C中。

3.3不同地区粘豆包酸面团真菌多样性分析

利用DGGE电泳技术分析不同地区粘豆包酸面团中真菌的多样性，结果如图3所示。

图3　不同地区样品真菌DGGE图谱Fig.3　DGGE profile of the fungi of DNA of samples from different regions

在4个样品中共发现了4个不同位置的条带，可见粘豆包酸面团真菌的多样性低于细菌的多样性。在4个来自不同地区的样品中，样品A（牡丹江市东宁县）的真菌条带最多。分析原因，牡丹江市东宁县位于黑龙江省的最南边，真菌的多样性很可能与当地的温度气候有关。通过基因测序分析（表1）可知：4个不同的条带分别代表：米根霉（Rhizopus oryzae）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和异常毕赤酵母（Pichia anomala）。其中米根霉只在样品A中出现，异常毕赤酵母只在样品B（哈尔滨市宾县）中出现。

4　讨论

在采集自黑龙江省不同县的粘豆包酸面团中，细菌的多样性高于真菌的多样性，且在细菌中以乳杆菌属为优势的菌属，这一研究结果与Liu T等的发现一致［10］。在4份样品中，植物乳杆菌、柠檬明串珠菌、热带假丝酵母和酿酒酵母均被检测到且条带颜色较深，这说明上述微生物在粘豆包酸面团的发酵过程中发挥了重要的作用，而在Zhang G等的研究也证明了上述结果［4］。此外，在个别的样品中罗伊氏乳杆菌、食窦魏斯氏菌、乳酸乳球菌、短乳杆菌、融合魏斯氏菌、米根霉、异常毕赤酵母也被发现，这些微生物都具有一定的发酵能力，能够产生独特的风味和口感。上述结果启发我们可以利用上述发酵微生物的混合物作为发酵剂应用于粘豆包的工业生产中，而发酵微生物的种类和配比还需进一步的研究。

同时，我们分析了不同地区粘豆包酸面团中微生物的多样性，发现粘豆包酸面团中微生物的多样性及微生物种类与样品采集地点具有一定的联系。在采集地较近的样品中细菌多样性较近，在较北的双鸭山宝清地区细菌的种类明显与其他3个样品不同，而在温度较高的牡丹江东宁地区真菌的多样性较高，且组成与其他地区不同。在杨健等［5］的研究中，样品采集地为黑龙江省肇州县，主要的菌株有地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和醋化醋杆菌等，其中地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和醋化醋杆菌在我们的研究中并没有发现，同时出现在本研究中的一些具有发酵能力的微生物在肇州县粘豆包酸面团中也并被发现，这进一步说明了粘豆包酸面团中微生物的多样性具有一定的地域特色。

［1］孙大庆，李洪飞，杨健，等.东北粘豆包中一株罗伊氏乳杆菌的分离、鉴定与益生性质研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015（5）: 106-110

［2］刘少才.东北的老粘豆包［J］.中国保健食品，2014（12）:70-70

［3］李琦，程建军，李文鹏.发酵糯玉米粘豆包的优选乳杆菌鉴定筛选［J］.东北农业大学学报，2008，39（5）:106-109

［4］Zhang G，Sadiq F A，Zhu L，et al.Investigation of Microbial Communities of Chinese Sourdoughs Using Culture-Dependent and DGGEApproaches［J］.Journal of Food Science，2015，80（11）:M2535-M2542

［5］杨健，孙大庆.东北粘豆包发酵面团中细菌多样性研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015（5）:78-81

［6］Chen T，Deng K，Xin L，et al.Effect of the Different Composition of Wheat，Rice，Buckwheat，Sweet Potato and Corn on Sourdough Characteristics and Sensory of Mantou［J］.J Nutr Food Sci，2015，5:336 doi:10.4172/2155-9600.1000366

［7］费鹏，白洪健，程述震，等.PCR-DGGE法分析婴儿肠道菌群多样性［J］.食品与机械，2013，29（2）:60-63

［8］姚笛，孙大庆，李洪飞.东北粘豆包酸面团菌群多样性与自制酸面团中菌群变化规律的研究［J］.现代食品科技，2015（5）:90-95

［9］张巧云，孟祥晨.几种发酵豆酱的微生物组成及理化性质分析［J］.食品科技，2013（8）:266-270

［10］Liu T，Li Y，Chen J，et al.Prevalence and diversity of lactic acid bacteria in Chinese traditional sourdough revealed by culture dependent and pyrosequencing approaches［J］.Lwt-Food Science and Technology，2016，68:91-97

Microbial Diversity Analysis of Sticky Bean Bun Sourdough from Different Regions

TAO Dong-ya1，JIN Yin-qi2
（1.Mechanical and Electrical Engineering College，Taizhou Vocational and Technical College，Taizhou 318000，Zhejiang，China；2.Taizhou Guang-yue Drinking Water Equipment Co.，LTD.，Taizhou 318020，Zhejiang，China）

In this study，as the research objects，the sticky bean bun sourdough from different regions were collected，and analyzed using the denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）and gene sequencing technology to reveal the diversity of bacteria and fungi in these samples.The results showed that the diversity of bacteria was higher than that of fungi in all four samples.There were seven different bacteria strains，and four different fungi strains，among them，the Lactobacillus was The most abundant genus.By comparing the diversity of samples from different regions，it was found that there was a connection between microbial diversity of sticky bean bun and collection regions.

sticky bean bun sourdough；microbial diversity；denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）；gene sequencing

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.037

2014年浙江省生态省建设目标责任制考核重大科技项目；台州市科技计划重点项目（14GY07）；2014年度浙江省高校国内访问工程师校企合作项目（FG2014131）

陶东娅（1983—），女（汉），讲师，硕士研究生，主要研究方向：纯水机控制、食品机械。

2016-04-19