梭子蟹中硒形态分析及其分布研究

鲁丹，俞琰垒，张虹（.浙江出入境检验检疫局，浙江杭州3006；.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州3003）



梭子蟹中硒形态分析及其分布研究

鲁丹1，俞琰垒2，张虹2
（1.浙江出入境检验检疫局，浙江杭州310016；2.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310013）

为研究梭子蟹中硒的赋存形态，并进一步探究梭子蟹硒蛋白组分中硒含量的分布，以梭子蟹为研究对象，采用透析法提取有机硒、连续提取法提取不同种类蛋白质、热水浸提法提取多糖、原子荧光光谱法测定原料和各组分中的含硒量。结果表明：梭子蟹中64.5%的硒是以有机硒形态存在，并主要与蛋白结合（蛋白硒占总硒的48.8%）；碱溶性蛋白和水溶性蛋白是梭子蟹结合硒的主要蛋白，总结合硒量占蛋白硒含量的77.9%，按照结合硒量的多少，硒在蛋白中的分布依次是：碱溶性蛋白＞水溶性蛋白＞盐溶性蛋白＞醇溶性蛋白；也有部分硒和多糖结合，占总硒含量的3.59%。

梭子蟹；有机硒；蛋白硒；多糖硒

硒是一种人体必需的具有抗氧化特性的微量元素，其预防人类癌症的潜在作用已受到高度重视［1］。研究表明，硒的生物利用率与其化学形态和分布密切相关，因此，硒在天然产物中的形态分布极其重要［2］。随着越来越多的硒的生理生化活性被发现，有关元素硒的研究逐渐延伸到生命科学领域。硒对人体健康的影响取决于其含量和所处的化学形态，研究证明，有机硒的生物医学功能大于无机硒，而且毒性比无机硒小。有关硒的形态分析，有应用联用技术连续测定无机硒、有机硒及多种硒化物［3］，还有硒的离线分离及检测［4-7］。

硒可通过食物链富集，海洋生物能从海水中富集硒，故海产品中硒的含量一般较高，是人们获得硒的一个重要饮食来源。海产品梭子蟹肉多味美，富含蛋白质及多种矿物质，营养丰富，目前有关梭子蟹中硒形态分析的研究未见报道。为获得硒在梭子蟹中赋存形态及其分布信息，本研究运用现代生物学的原理和原子荧光光谱技术，采用分别分离纯化蛋白质和多糖，细胞蛋白质在分离的基础上，再按其与不同溶剂溶解性不同进行分离纯化，然后对硒含量进行测定，研究了硒在梭子蟹中的赋存形态及分布规律，指导科学膳食。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

AFS-9130双道原子荧光光度计：北京吉天仪器有限公司；MARS5微波消解仪：美国CEM公司；2100紫外分光光度计：尤尼科UNICO公司；SORVALL RC6超速冷冻离心机：美国Thermo公司；Labconco低温真空冷冻干燥机：美国Labconco公司；恒温水浴振荡器。

丙酮；硫酸铵；氯化钡；浓硫酸；浓硝酸；过氧化氢；浓盐酸；透析袋（3 500 Da）：Solarbio进口分装；Millipore超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）；0.5 mol/L氯化钠溶液；50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）；75%（v/v）乙醇溶液；0.1 mol/L氢氧化钠溶液；胰蛋白酶：酶活力≥2 500 U/mg；除蛋白液：正丁醇∶三氯甲烷=1∶4（v/v）；浓盐酸（ρ1.19 g/mL）：优级纯。载流：盐酸（2+98）：浓盐酸20 mL，用水稀释至1 000 mL。硼氢化钠（10 g/L）-氢氧化钠（5 g/L）溶液：称取5.0 g氢氧化钠溶于约200 mL水中，加入10 g硼氢化钠，溶解后用水稀释并定容至1 000 mL，摇匀。现用现配。铁氰化钾（100 g/L）：称取10 g铁氰化钾用水溶解后以水稀释到100 mL，摇匀。硒标准储备溶液：1 000 mg/L（国家钢铁材料测试中心），硒标准使用液（1.0 μg/mL）：由硒标准储备用以盐酸（2+98）逐级稀释而成。

1.2仪器工作条件

1.2.1微波消解条件

功率1 600 W，120℃，升温时间5 min，保持时间5 min；180℃，升温时间5 min，保持时间15 min。

1.2.2顺序注射-氢化物发生-原子荧光光度仪测定条件

光电倍增管负高压：300 V；载气流量：400 mL/min；屏蔽气流量：800 mL/min；灯电流：80 mA；原子化器高度：8 mm；原子化温度：200℃；进样量：1 mL；测量方法：标准曲线法；读数方式：峰面积；延迟时间：1.5 s；读数时间：7 s。

1.3方法

1.3.1有机硒的提取与测定

采用持续透析法，称取20 g梭子蟹试样（精确到0.1 mg）装入透析袋中，加入300 mL水在烧杯中透析96 h，每隔12小时换一次水，直至用10%BaCl2检验透析外液中无SO42-。将透析后样品真空冷冻干燥，测定硒含量［8-9］。

1.3.2不同种类硒蛋白的提取及其结合态硒含量的测定

1.3.2.1总可溶性硒蛋白的提取［10］及其结合态硒含量测定

准确称取15 g梭子蟹试样（精确至0.1 mg）至烧杯中，加入0.25mol/L NaOH450 mL，室温下搅拌提取4 h，过滤，得到上清液。滤渣加0.25 mol/L NaOH溶液200 mL反复提取2次，合并3次滤液，加入硫酸铵至饱和度为95%，4℃静置12 h。8 000 r/min离心10 min沉淀以pH8.0 Tris-HCl缓冲液50 mL溶解。4℃下用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液1 L透析3次（至用10% BaCl2检验呈阴性后）。所得蛋白质溶液真空冷冻干燥，测定硒含量。

1.3.2.2水溶性硒蛋白的提取及其结合态硒含量测定

准确称取梭子蟹试样15 g（精确至0.1 mg），加入90 mL经-40℃预冷的丙酮，冰上搅拌脱脂3 h，4℃8 500 r/min离心15 min，弃上清，挥干丙酮。沉淀加入450 mL水，室温下搅拌提取4 h，4℃8 500 r/min离心15 min，取上清液。重复2次，合并3次所得上清液，加入硫酸铵至饱和度为95%，4℃静置过夜，离心收集沉淀，用少量去离子水溶解，4℃下依次用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液、去离子水透析（3.5 kDa），至质量分数为10%BaCl2检验呈阴性。所得蛋白质溶液真空冷冻干燥，测定硒含量。

1.3.2.3盐溶性硒蛋白的提取及其结合态硒含量测定

在提取水溶性蛋白后的残渣中，加入0.5 mol/L氯化钠溶液450 mL，室温下搅拌提取4 h，4℃8 500 r/min离心15 min，取上清液。重复2次，合并3次所得上清液，加入硫酸铵至饱和度为95%，4℃静置过夜，离心收集沉淀，用0.5 mol/L氯化钠溶液溶解、透析。所得蛋白质溶液真空冷冻干燥，测定硒含量。

1.3.2.4醇溶性硒蛋白的提取及其结合态硒含量测定

在提取盐溶性蛋白后的残渣中，加入75%（v/v）乙醇溶液450 mL，室温下搅拌提取4 h，4℃8 500 r/min离心15 min，取上清液。重复2次，合并3次所得上清液，加入硫酸铵至饱和度为95%，4℃静置过夜，离心收集沉淀，用75%（体积分数）乙醇溶解、透析。所得蛋白质溶液真空冷冻干燥，测定硒含量。

1.3.2.5碱溶性硒蛋白的提取及其结合态硒含量测定

在提取醇溶性蛋白后的残渣中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液450mL，室温下搅拌提取4 h，4℃8 500 r/min离心15 min，取上清液。重复2次，合并3次所得上清液，加入硫酸铵至饱和度为95%，4℃静置过夜，离心收集沉淀，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液溶解、透析。所得蛋白质溶液真空冷冻干燥，测定硒含量。

1.3.3可溶性硒多糖的提取及其结合态硒含量测定

准确称取梭子蟹试样15 g（精确至0.1 mg），加入90 mL经-40℃预冷的丙酮，冰上搅拌脱脂3 h，4℃8 500 r/min离心15 min，弃上清液，挥干丙酮。沉淀加入水375 mL，75℃水浴浸提5 h，8 500 r/min离心15 min，收集上清液。加入3倍体积乙醇，4℃静置过夜，离心收集沉淀。沉淀用去离子水溶解，冷冻干燥得到粗多糖。采用胰蛋白酶+Sevag法脱蛋白，用3倍体积乙醇沉淀多糖，沉淀用去离子水溶解后，透析［11］。所得多糖溶液真空冷冻干燥，测定硒含量。

1.3.4蛋白质含量的测定

考马斯亮蓝G-250染色法［12］。

1.3.5多糖含量的测定

苯酚-硫酸比色法［13］。

1.3.6总硒含量的测定

微波消解-氢化物原子荧光法［14］。

2　结果与讨论

2.1梭子蟹中水分、粗蛋白、总糖的测定

本试验测得新鲜梭子蟹肉中水分、粗蛋白、总糖含量见表1。

表1　梭子蟹中水分、粗蛋白、总糖的测定结果（n=3）Table 1　Determination results of moisture，crude protein，total sugar in swimming crab（n=3）

2.2梭子蟹中硒的分布

将梭子蟹中有机硒提取后测定其中硒含量，总硒与有机硒之差即为无机硒含量，结果见表2。

表2　梭子蟹中总硒、有机硒、无机硒含量的测定结果（n=5）Table 2　Determination results of Contents of total Se，organic Se and inorganic Se in swimming crab（n=5）

由表2可知，梭子蟹是富硒食品［15］，且梭子蟹中有机硒占总硒的64.5%，无机硒占总硒的35.5%。由此可见，有机硒是梭子蟹中硒的主要赋存形态。

2.3梭子蟹中有机硒的分布

将梭子蟹中的蛋白质和多糖分别提取、纯化后测定其中硒含量，结果见表3。

表3　梭子蟹中有机硒的分布（n=5）Table 3　Distribution of organic Se in swimming crab（n=5）

由表3可知，梭子蟹中与蛋白质结合的硒占有机硒的75.7%、总硒的48.8%，与多糖结合的硒占有机硒的5.57%、总硒的3.59%，其他形态结合的占有机硒的18.7%，包括脂肪硒和一些小分子硒化合物。按照结合硒量的多少，有机硒和总硒在蛋白质和多糖中的分布为蛋白质硒＞多糖硒。这说明蛋白质硒是梭子蟹中硒的主要赋存形态，但也有部分硒与多糖等非蛋白质形式存在。

2.4梭子蟹中蛋白硒的分布

为进一步获得梭子蟹中蛋白硒的分布信息，根据蛋白质在不同溶剂中的溶解性不同，采用连续提取法依次用水、氯化钠溶液、乙醇溶液和氢氧化钠溶液为溶剂提取梭子蟹中的水溶性蛋白、盐溶性蛋白、醇溶性蛋白和碱溶性蛋白，蛋白质溶液经透析、真空冷冻干燥后，测定其中硒含量。结果见表4。

表4　梭子蟹中蛋白硒的分布（n=5）Table 4　Distribution of protein-bound Se in swimming crab（n=5）

由表4可知，硒在四种不同溶解性的蛋白质中的分布不等。碱溶性蛋白中硒的含量最高（占总有机硒的41.1%），而盐溶性蛋白质最少（占总有机硒的7.92%）。而以75%乙醇提取的蛋白未检测到硒。这一结论和巴西坚果的测定一致［16］。按照结合硒量由大到小依次为：碱溶性蛋白结合硒（占蛋白硒54.3%）＞水溶性蛋白结合硒（占蛋白硒23.6%）＞盐溶性蛋白结合硒（占蛋白硒10.5%）＞醇溶性蛋白结合硒（未检出）。由此可见，碱溶性蛋白和水溶性蛋白是梭子蟹结合硒的主要蛋白，总结合硒量占总蛋白硒含量的77.9%、占总有机硒含量的59.0%、占总硒含量的38.0%。开发利用梭子蟹中蛋白硒，主要以碱溶性蛋白和水溶性蛋白为主。

2.5回收率和精密度试验

采用添加法在总硒本底含量为0.529 mg/kg的梭子蟹肉中添加0.100、1.00、2.00 mg/kg 3个不同浓度水平的硒标准溶液，进行回收率和精密度测定。每个浓度水平单独测定6次，结果回收率为94.0%～102%、相对标准偏差为1.80%～2.61%，提示本法具有良好的准确性和重现性。

3　结论

有机硒是梭子蟹中硒的主要赋存形态，且主要是蛋白硒，其结合的硒量占有机硒的75.7%、总硒量的48.8%。按照结合硒量的多少，有机硒和总硒在蛋白质和多糖中的分布为蛋白质硒＞多糖硒。碱溶性蛋白和水溶性蛋白是梭子蟹结合硒的主要蛋白，总结合硒量占总蛋白硒含量的77.9%、占总有机硒含量的59.0%、占总硒含量的38.0%。表明梭子蟹中大多数的含硒蛋白可能是酸性的或极性较强的蛋白。本研究为合理开发利用富硒海产品，帮助人们合理选择健康的富硒产品，科学膳食和选择补硒产品及完善富硒海产品标准提供了重要的理论依据。

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Study on Distribution and Combined Forms of Selenium in Swimming Crab

LU Dan1，YU Yan-lei2，ZHANG Hong2
（1.Zhejiang Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hangzhou 310016，Zhejiang，China；2.College of Food Science and Biotechnology Engineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310013，Zhejiang China）

For studying the combined form of selenium in swimming crab，and further Exploreing the distribution of swimming crab selenium content in selenium protein components，organic selenium was extracted by dialysis method，different proteins were extracted by continuous extraction method，and polysaccharides were extracted with hot water，the contents of selenium were determined by atomic fluorescence spectrometry.The results showed that 64.5%of total Se were in the organic form，and mainly associated with the protein in swimming crab.Se bound to the protein extracts accounted for 48.8%of total Se.Moreover，77.9%of Se bound to protein was incorporated with alkali-soluble and water-soluble protein extracts.The amount of Se existed in the different protein fractions decreased in the order of alkali-soluble，water-soluble，sodium chloride-soluble and ethanol-soluble protein extracts，and 3.59%of selenium was observed to be bound to polysaccharides.

swimming crab；organic selenium；protein selenium；polysaccharide selenium

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.026

国家质检总局科技计划项目（2011IK247）

鲁丹（1964—），女（汉），研究员，学士，研究方向：食品元素及其形态分析。

2015-03-30