透明质酸海洋胶原肽粉中β-胡萝卜素的测定

王海东，姜水红，查圣华，张宏（北京同仁堂健康药业股份有限公司，北京100085）



透明质酸海洋胶原肽粉中β-胡萝卜素的测定

王海东，姜水红，查圣华，张宏
（北京同仁堂健康药业股份有限公司，北京100085）

建立透明质酸海洋胶原肽粉中β-胡萝卜素的含量测定方法。样品经淀粉酶处理后，用乙醇和三氯甲烷提取，离心，取上清液水浴蒸干，残渣用乙醇溶解后转移至氧化铝柱进行层析纯化。采用Waters XBridgeTMShield RP18色谱柱，以甲醇∶乙腈=90∶10（体积比）为流动相，PDA检测器检测。结果表明，在0～50 μg/mL范围内β-胡萝卜素呈线性关系（R2＞0.999），回收率为100.0%（RSD=2.3%，n=6）。该含量测定方法可用于以β-胡萝卜素为原料的保健食品的检测。

β-胡萝卜素；HPLC；含量

类胡萝卜素是四萜类化合物。在众多类胡萝卜成分之中，β-胡萝卜素作为维生素A的前体，早已备受临床医药界的关注。近年来随着类胡萝卜素的应用与研究在临床医学、临床药理、食品工业、及化妆品工业的迅猛发展，特别是90年代以来，有关专家对其作用机制在流行病学、保健预防疾病的作用方面进行了广泛和深入的研究探讨，并取得了相当的成果［1］。β-胡萝卜素不仅是人体内维生素A的重要来源，而且其本身对人体也具有很重要的生理功能，它可以预防、延缓和治疗某些疾病，尤其是癌症，同时也能提高机体的免疫功能［2］。β-胡萝卜素还作为食品添加剂和营养增补剂，被联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）食品添加剂联合专家委员会推荐，被认为A类优秀和有营养的食品添加剂［3］。近年来国内对其关注越来越高，其研究和探讨也十分活跃。

目前一些添加了β-胡萝卜素成分的保健食品为了保证该成分的稳定性，对其进行了包埋处理，当采用国标法GB/T 5009.83-2003《食品中胡萝卜素的测定》第一法进行测定时，结果比添加量明显偏低，针对这一现象，该文在国标法基础上，增加了样品去包埋前处理过程，并对修改后的方法进行了全面的方法学验证。

1　材料与方法

1.1仪器

2695-2998高效液相色谱仪：美国Waters公司；CPA225D电子天平：德国Sartorius公司；3-15离心机：德国Sigma公司；KQ3200DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DZKW-D-4电热恒温水浴锅：北京永光明医疗仪器厂。

1.2试剂

β-胡萝卜素标准品（中国食品药品检定研究院，30.9%），甲醇和乙腈（色谱纯，J.T.Baker），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3样品

透明质酸海洋胶原肽粉由北京同仁堂健康药业股份有限公司提供。

2　方法

2.1色谱条件

色谱柱：Waters XBridgeTMShield RP18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）；流动相∶甲醇∶乙腈=90∶10（体积比）；流速：1.2 mL/min；检测波长：448 nm；柱温：30℃。

2.2标准液

精确称取β-胡萝卜素32.36 mg于烧杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入100 mL棕色容量瓶中，用石油醚定容，浓度为100 μg/mL。

2.3试样制备（以下操作需避光进行）

2.3.1试样提取

取样品约1 g，精密称定，置于250 mL容量瓶中，再加入0.2 g淀粉酶，加10 mL 60℃的蒸馏水，并在60℃水浴中超声5min，加入100mL无水乙醇和100mL三氯甲烷，再次水浴超声处理5 min，冷却后加三氯甲烷稀释至刻度，摇匀，取出部分内容物置于具塞离心管内离心5 min（转速约4 000 r/min），吸取上清液5 mL于蒸发皿中，置于40℃水浴上挥干，然后加1 mL（95%）乙醇溶解残渣。

2.3.2纯化

将2.3.1的试样提取液残渣溶解液，用少量石油醚溶解，然后进行氧化铝层析。氧化铝柱为1.5 cm（内径）× 4 cm（高）。先用洗脱液丙酮+石油醚（丙酮与石油醚体积比为5∶95）洗氧化铝柱，然后再加入溶解试样提取液的溶液，用丙酮+石油醚（5+95）洗脱β-胡萝卜素，控制流速为20滴/min，收集于10 mL容量瓶中，用洗脱液定容至刻度。用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液做HPLC分析用［4］。

2.4线性关系考察

分别吸取标准溶液各0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，各加移动相至刻度，摇匀后，分别取20 μL注入液相色谱仪，测定，以β-胡萝卜素含量为横坐标，以β-胡萝卜素峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2.5精密度实验

取同一试样溶液重复进样6次，以β-胡萝卜素峰面积计，计算6次峰面积的RSD。

2.6稳定性实验

取1份样品溶液，在4℃避光密封储存条件下，分别于0、6、12、24、36、48、72 h时取出，缓温至室温，测定。

2.7重复性实验

取样品6份，制备试样溶液，分别取20 μL注入液相色谱仪，计算β-胡萝卜素的含量。

2.8加标回收率实验

取已知含量样品6份，分别置250 mL量瓶中，加10 mL 60℃的蒸馏水，再加入0.2 g淀粉酶，并在60℃水浴中超声5 min，加入100 mL无水乙醇和100 mL三氯甲烷，然后加入对照品溶液（1 952 μg/mL）1.0 mL，按2.3方法继续制备供试品溶液，进样20 μL，测定含量。

2.9检出限与定量限

配制一系列浓度的标准溶液，取20 μL注入液相色谱仪，以β-胡萝卜素峰计算信噪比。

3　结果

3.1线性关系

标准曲线回归方程为Y＝207 427x-13 758，R2= 0.999 6，线性范围：0～50 μg/mL，线性良好，见图1。

图1　标准品重叠谱图Fig.1　Overlapping spectra of the standard

3.2精密度实验

6次峰面积的RSD=0.2%，进样精密度良好，见图2。

图2　进样精密度重叠谱图Fig.2　Overlapping spectra of the sampling precision

3.3稳定性实验

试验结果以β-胡萝卜素峰面积计，RSD=0.63%，说明样液在72 h内稳定，见图3。

图3　试样溶液稳定性重叠谱图Fig.3　Overlapping spectra of sample solution stability

3.4重复性试验

6份样品结果的RSD=1.2%，试验重现性良好，见表1。

表1　重复性试验结果Table 1　The results of the repetitive experiment

3.5加标回收率

β-胡萝卜素的平均回收率为100.0%，RSD=2.3%。见表2。

表2　回收率试验结果Table 2　The results of the recovery experiment

3.6检出限与定量限

标准溶液浓度为0.01 μg/mL时，信噪比为4.6＞3，可设为检出限；浓度为0.03 μg/mL时，信噪比为14.4＞10，可设为定量限，并对其重复进样6次，以β-胡萝卜素峰面积计，RSD为2.5%，精密度良好，见表3和表4。

表3　标准溶液信噪比Table 3　The signal-to-noise ratio of the standard solution

表4　定量限重复性Table 4　The repetitive experiment ofthe loq

4　结论

β-胡萝卜素在448 nm处吸收峰峰形对称良好，无过多干扰峰；此方法样品分析时间短，重现性、稳定性及准确度良好，在0～50 μg/mL范围内线性关系良好，可为保健食品及原料中β-胡萝卜素的含量测定提供参考。

5　讨论

样品中β-胡萝卜素因为加包埋处理，直接用国标法GB/T 5009.83-2003《食品中胡萝卜素的测定》中第一法检测，结果比实际添加量偏低很多，所以添加淀粉酶去包埋处理样品，使结果更加准确。同时试验要注意在避光下操作，标准品应低温避光保存，而且最好以新购未开封标准品为宜，否则将对试验结果产生较大影响。

［1］王庆伟.类胡萝卜素的研究进展与临床应用［J］.中国药事，2000，14（1）:58-60

［2］朱秀灵，车振明，徐伟，等.β-胡萝卜素的生理功能及其提取技术的研究进展［J］.广州食品工业科技2004，20（2）:158-162

［3］唐刘蕴泉，蔡皓.β-胡萝卜素应用的研究进展［J］.肠外与肠内营养，2005，12（2）:121-123

［4］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.83-2003《食品中胡萝卜素的测定》［S］.北京:中国标准出版社，2003:3-4

Determining the Content of Carotenoids in Hyaluronic Acid Marine Collagen Peptide Powder

WANG Hai-dong，JIANG Shui-hong，ZHA Sheng-hua，ZHANG Hong

（Beijing TongRenTang Health-Pharmaceutical Co.，Ltd.，Beijing 100085，China）

A practical method for determining the content of carotenoids in hyaluronic acid marine collagen peptide powder was established.After the samples were processed by amylase，extracted with ethanol and chloroform，centrifugal，and the extract was to dry in a water bath，then the residue after dissolved with ethanol and transferred to the alumina column chromatography purification.Using the chromatographic column of Waters XBridgeTMShield RP18；mobilephase，methanol∶acetonitrile=90∶10（volume ratio）；tested with the PDAdetector.Result showed that the linear relationship was good in the range of 0-50 μg/mL for carotenoids，（R2＞0.999）.The recovery of carotenoids was 100.0%（RSD=2.3%，n=6）.This method can be used for detecting health care food with beta carotene as raw materials.

β-carotene；HPLC；content

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.13.023

国家863计划项目（2014AA022109）

王海东（1987—），男（汉），助理工程师，学士，研究方向：食品药品质量研究。

2015-07-09