橙皮多糖组成、理化性质及抗氧化性检测*

2016-09-01乔立龙程翠利周春姣王辉宪蒋红梅

广州化工 2016年1期

关键词：橙皮葡萄糖多糖

乔立龙，程翠利，周春姣，王辉宪，蒋红梅

(湖南农业大学理学院，湖南　长沙　410128)

橙皮多糖组成、理化性质及抗氧化性检测*

乔立龙，程翠利，周春姣，王辉宪，蒋红梅

(湖南农业大学理学院，湖南长沙410128)

探索并优化了橙皮多糖的提取工艺条件，检测纯化后橙皮多糖的组成，理化性质及抗氧化性；方法：采用用单因素及正交实验设计探索并优化超声波辅助提取橙皮多糖的工艺条件，粗多糖经氯仿:正丁醇(5:1，V:V)去蛋白、浓缩、乙醇沉淀后冷冻干燥，利用离子色谱技术分析纯化后橙皮多糖的组成，采用常规理化检测方法及体外抗氧化实验检测了纯化后橙皮多糖的理化性质及抗氧化性能力。结果表明离子色谱法测得橙皮多糖由3种单糖组成，分别为鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸；理化性质实验结果显示，橙皮多糖溶于水，微溶于体积分数为95%乙醇，不溶于乙醚、丙酮，灰分含量为0.1191%，蛋白质含量为0.15 mg/g抗氧化能力低于抗坏血酸(Vc)和2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，橙皮粗多糖抗氧化能力优于精制橙皮多糖。

多糖；橙皮；组成；理化性质；抗氧化能力

陈皮，为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，是传统中药材。具有理气健脾，调中，燥湿，化痰等功效。在《本草纲目》、《日用本草》中均有记载。橙皮中富含丰富的色素、苷类、果胶、纤维、香精油、矿物质、多糖。目前, 国内外对柑、橘、橙、柚等同类果实果皮的利用主要体现在药品、食品及化妆品的香精油、色素、果胶、苷类的提取[1-5]。

多糖即多聚糖(Polysaccharide)一般是指由十个或十个以上的单糖通过糖苷键聚合而成的一种生物大分子，其分子量可以从几千到数百万[6-9]。多糖不仅是生物体的重要营养物质，而且在生命活动中发挥着关键作用[10]，广泛分布于生物界特别是植物界[11-12]。近几十年的研究发现,从植物中提取的多糖拥有免疫调节、抗肿瘤以及降血脂、抗氧化、抗病毒等生物活性[13-17]。利用植物多糖的生物活性，将具有广阔的应用前景。本实验以水作为提取剂提取橙皮多糖，分析了橙皮多糖的组成，理化性质及抗氧化性研究。为橙皮多糖的开发与利用提供基础数据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

脐橙(Citrus sinensis Osbeck)，湖南永州。

葡萄糖标准品(纯度≥98%)，中国食品药品检定研究院；抗坏血酸(AR)，中国医药上海化学试剂公司；2,6-二叔丁基对甲酚(AR)，上海凌峰化学试剂有限公司；三吡啶基三嗪(AR)，东京化成工业株式会社；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(AR)，东京化成工业株式会社；其它试剂为国产分析纯。

RE-2000B旋转蒸发仪，巩义市予华仪器；真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器；SHIMADZU UV-2450型紫外可见分光光度计，日本岛津； SB25-12DT超声波清洗机，宁波新芝生物科技；DIONEX ICS-900离子色谱仪，美国戴安；DIONEX PAD-2 脉冲安培检测器，美国戴安；METROSEP CARB(150 mm×4.0 mm)阴离子交换柱，瑞士万通。

1.2方法

1.2.1葡萄糖标准曲线制作

精密称取于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100 mg，定容至100 mL容量瓶中，得质量浓度为1 mg/mL的葡萄糖标准液。精密吸取0.1 g/L标准葡萄糖溶液0.0 mL, 0.2 mL, 0.4 mL, 0.6 mL, 0.8 mL, 1.0 mL，1.2 mL于10 mL具塞试管中，补加蒸馏水至2 mL，分别加入5%苯酚溶液1 mL，混合均匀后快速加入浓硫酸5.0 mL，即刻摇匀，室温静置20 min，在波长200～800 nm之间扫描，确定最佳吸收波长为490 nm，在此波长处测定吸光度，得回归方程：A=0.0438C+0.0054，相关系数R2=0.9997。A为吸光度，C为葡萄糖浓度。

1.2.2橙皮多糖的提取和含量测定流程

新鲜脐橙皮→干燥→粉碎→干粉→蒸馏水→超声→定容→离心→取上层清液(浓缩可得橙皮粗多糖)→同标准曲线制作步骤测定吸光度→根据回归方程计算含量

提取液中多糖质量(以葡萄糖当量计算)=c×V×稀释倍数

式中：c——标准曲线上查得的葡萄糖浓度，mg/mL

V——橙皮多糖提取液体积，mL

1.2.3橙皮多糖提取条件优化

称取1 g橙皮粉末，通过超声波辅助法进行橙皮多糖的提取，固定液固比45:1，超声温度60 ℃，超声时间30 min，提取一次。分别考察液固比、超声温度、超声时间对橙皮多糖提取率的影响。根据单因素试验结果，设计L9(33)正交试验表，进行正交试验，优化橙皮多糖的提取工艺。

1.2.4橙皮多糖的纯化

橙皮多糖提取液→Sevage法[18]除蛋白→旋转蒸发浓缩→乙醇沉淀24 h→离心→沉淀→丙酮、乙醚洗涤抽滤→真空冷冻干燥→精制橙皮多糖

1.2.5离子色谱法测定橙皮多糖的单糖组成

准确称取精制橙皮多糖51.0 mg于100 mL容量瓶中，用1 mol/L醋酸水溶液定容至100 mL，超声6 h。多糖水解液经C18柱过滤，滤液转入样品管中，进行离子色谱单糖检测分析。

检测条件：仪器型号：ICS-900；检测器：脉冲安培检测器；METROSEP CARB(150 mm×4.0 mm)阴离子交换柱；进样体积10.0 mL；淋洗液：6.0 mmol/L NaOH；流速：1.0 mL/min，柱温：32 ℃；再生液：200 mmol/L NaOH；分析时间为60 min。

1.2.6橙皮多糖理化性质的研究

橙皮多糖溶解性及其水溶液pH值实验：提取的粗多糖经纯化后，观察其颜色、状态、气味；取等量纯化后多糖分别溶于水、乙醇、乙醚、丙酮，观察溶解情况。取一定量纯化后橙皮多糖水溶液测定pH值。

灰分含量的测定：用灼烧至恒重的坩埚称取经P2O5干燥至恒重的纯化后橙皮多糖样品50～100 mg(精确至0.0002 g)，置马弗炉于740 ℃下灼烧12 h，烧至恒重为止，冷却至室温，称重。

水溶液特性黏数测定：根据《黏度测定法中国药品检验标准操作规范2010版》中第三种方法测定特性黏数。

蛋白质含量测定：参照文献[19]的方法，测定纯化后橙皮多糖中蛋白质的含量。

糖醛酸检测：糖醛酸与咔唑反应生成紫红色化合物，用硫酸-咔唑反应可以鉴别有无糖醛酸。试剂配制：称取咔唑0.125 g 溶于100 mL体积分数95%乙醇中，置于棕色试剂瓶中4 ℃保存。测量步骤如下：将质量浓度为12 mg/mL的纯化后橙皮多糖水溶液2.0 mL缓慢加入盛有12.0 mL浓硫酸的大试管中，然后在沸水浴中加热10 min，冷却至室温，加入上述咔唑乙醇溶液0.4 mL，充分混匀，室温下放置30 min，观察有无紫红色化合物生成。

淀粉检测：利用稀释的碘-碘化钾溶液与淀粉作用时，形成碘化淀粉，呈蓝色的特殊反应，可以用来鉴定有无淀粉。所需试剂为碘化钾3 g，蒸馏水100 mL，碘1 g。先将碘化钾溶于蒸馏水中，待全部溶解后再加碘，振荡溶解。取1.0 mg/mL的橙皮多糖溶液1.0 mL，加入碘-碘化钾试剂2滴，观察颜色变化。以蒸馏水为阴性对照，1.0 mg/mL 淀粉溶液为阳性对照。

1.2.7橙皮多糖抗氧化能力测定

2　结果与分析

2.1超声波辅助法提取橙皮中多糖的提取工艺优化

图1　固液化、超声时间和超声温度对萃取剂产量的影响

考察不同料液比、超声时间、超声温度等因素对橙皮多糖得率的影响见图1。可以看出，超声温度为60 ℃时，橙皮粗多糖得率达到最大值，随后随温度的升高提取率反而下降，这可能是因为过高的温度导致了部分多糖的分解或与其它杂质发生了反应。料液比对橙皮多糖得率有明显的影响，当料液比达到 1:45时，橙皮多糖得率达到最大值。超声时间比对橙皮粗多糖得率的影响较小，当时间从 10 min增加到20 min时，多糖得率升高，之后随着时间的增加，多糖得率趋于平稳。

根据单因素试验结果，设计L9(33)正交试验表，进行正交试验，结果见表1。正交实验的极差分析结果表明：橙皮多糖提取率的影响因素为料液比>超声温度>超声时间。料液比为1:15，时间为20 min，温度为70 ℃为最佳提取工艺，此时橙皮多糖的得率为6.32%。为了验证实验的可靠性，设计最佳工艺的平行实验，平行实验结果证明实验的重复性可靠。

表1　正交试验

2.2离子色谱法检测橙皮多糖的单糖组成

按1.3.5方法对纯化后橙皮多糖进行处理，用离子色谱法检测橙皮多糖分子中的单糖组成。检测结果见图2。由图2可以看出，橙皮多糖主要由三种单糖组成，即鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸，半乳糖醛酸含量53.909 mg/g最多，只含少量的鼠李糖、葡萄糖。

表2　橙皮多糖的离子色谱

2.3橙皮多糖理化性质检测结果

按1.3.6方法对纯化后橙皮多糖的理化性质进行了检测，检测结果显示：橙皮多糖溶于水，微溶于95%乙醇，不溶于乙醚、丙酮；其溶液的pH值为5.83；灰分含量为0.1191%；蛋白质含量为0.15 mg/g；硫酸-咔唑反应有紫红色化合物生成，说明精制橙皮多糖里面含有较多的糖醛酸；碘-碘化钾反应颜色深于阴性对照浅于阳性对照，说明其淀粉含量很低。

2.4橙皮多糖抗氧化能力测定结果

图3　样品的抗氧化能力

3　讨　论

离子色谱法结果表明：橙皮多糖主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸三种单糖组成。橙皮多糖的硫酸-咔唑反应有紫红色化合物生成，进一步证实橙皮多糖里面含有较多的半乳糖醛酸；已有研究表明，半乳糖醛酸对癌细胞增殖具有一定的抑制作用，如糖聚合度为5的β-(1→4)-半乳寡糖醛酸(AOG)具有显著预防实验性结肠炎癌变(93.5%)的功能[23]，半乳糖醛酸增加改性后的甘薯果胶对结肠癌细胞HT-29、乳腺癌细胞Bcap-37增殖具有明显的抑制作用[24]。橙皮多糖是否同样具有抗癌细胞增殖能力还有待进一步证实，此外，橙皮多糖中单糖之间的连接方式、连接位置、分子量等信息仍不完整，还有待进一步深入细致的研究。

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Determination of the Monosaccharide Components, Physicochemical Property and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Orange Peel*

QIAO Li-long, CHENG Cui-li, ZHOU Chun-jiao, WANG Hui-xian, JIANG Hong-mei

(College of science, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128, China)