一种降低细菌纤维素分子量的方法*

张名楠，刘海芳，李玉洁，冯玉红

(1 海南大学材料化工学院，海南　海口　570228； 2 海口市人民医院，海南　海口　570208)



一种降低细菌纤维素分子量的方法*

张名楠1，刘海芳2，李玉洁1，冯玉红1

(1 海南大学材料化工学院，海南海口570228； 2 海口市人民医院，海南海口570208)

以实验室自行筛选的木醋杆菌(Acetobacterxylinum)为菌种，海南椰子水为主要培养体系，在生物合成过程中向培养基中添加半乳糖醛酸，采用静态培养方法制备了细菌纤维素(BC)，对BC的结构和性能进行了研究；结果表明: 添加半乳糖醛酸后，BC的产率、持水性能及热稳定性有所下降，而结构特征和结晶性能与不添加半乳糖醛酸的BC差别不大；但产物衍生化后的分子量却降低很大，约10万左右；有望用半乳糖醛酸代替蔗糖为碳源生产低分子量的细菌纤维素。

细菌纤维素；半乳糖醛酸；低分子量

图1　半乳糖醛酸的结构

细菌纤维素(BC)是一种以木醋杆菌(AcetobacterXylinum, A.x) 等细菌分泌的一种胞外多糖。BC具有植物纤维素无法比拟的一些优良性能，如纯度高、结晶度高、极佳的形状维持能力和抗撕力等，因而受到广泛关注[ 1-3]，并且BC在其合成时一些性能可调控[4-5]，因此被认为是最好的纤维素。在应用过程中，BC因其分子量大很难溶解制约了它的一些应用，因此有必要生产低分子量的BC。几年前本课题组的冯玉红[6]就通过改变实验的条件如温度等合成了低相对分子质量的细菌纤维素；另外，Kunihiko Waanabe等[7]通过在合成体系中添加一些不能使分子链端再增长的封端单体，如甘油(glycerol)来达到生物合成控制分子量的目的。所以本研究设想添加一些阻止分子链端增长的封端底物分子，比如半乳糖醛酸(Galacturonic acid)替代蔗糖直接作为碳源合成入产物分子中，使不再具备使纤维素分子链再增长的结构；由此可达到控制分子链增长的目的，实现分子量控制。

1　实　验

1.1主要原料、试剂和仪器

菌种：木醋杆菌(Acetobacter xylinum)本实验室自行筛选；椰子水：新鲜的海南椰子水，室温放置发酵4 d；半乳糖醛酸(分析纯，阿拉丁试剂)；其他试剂均为分析纯。

傅里叶变换红外光谱仪(TENSOR27型)：德国Bruker公司；扫描电镜(S-3000N)：日本Hitachi公司；多晶X射线衍射仪(D8 Advance)：德国Bruker公司；热失重分析仪(SDT-Q600)：美国TA公司；凝胶色谱分析仪(Waters1515 HPLC泵，Waters2414示差检测器)：美国Waters公司。

斜面培养基(g/L): 硫酸镁0.25，硫酸铵1.5，琼脂8.5，椰子水；pH=4.0。高温灭菌15 min。

种子培养基(g/L):蔗糖20，硫酸镁0.25，硫酸铵1.5，磷酸二氢钾0.5，发酵的椰子水；pH=4.0。高温灭菌15 min。

发酵培养基(g/L):蔗糖10，硫酸镁0.25，硫酸铵1.5，磷酸二氢钾0.5，半乳糖醛酸10，发酵的椰子水；pH=4.0。高温灭菌15 min。

1.2BC膜的制备及纯化

1.2.1BC膜的制备

取一环活化好的斜面菌种接入种子培养基，在直径为10 cm 的培养皿中，室温静置培养1.5 d，以5%的接种量接入100 mL的发酵培养基，在2份发酵培养基里面分别添加蔗糖和半乳糖醛酸，充分振荡。加NaOH将其pH值调至3.5～5.0。接种培养5 d，膜的厚度基本上不变时，从培养箱中取出，得到透明凝胶膜。

1.2.2BC膜的纯化

将凝胶状膜用水冲洗12 h，后用250 mLρ(NaOH)=10 g/L的NaOH溶液煮2 h，再用弱酸调节pH=7.0，最后用二次水冲洗，得凝胶状BC膜，然后冷冻干燥至恒重，得到干态BC薄膜。

1.3持水率测试

用纸吸取BC薄膜表面的水分，所得膜定义为湿膜，称其湿膜质量m1；冷冻干燥至恒重，所得膜定义为干膜，其质量为m2。持水率按(1)式计算：

(1)

1.4BC薄膜的产率

膜冷冻干燥至恒重，称其质量为m(g)，培养皿中原培养液体积为V(L)，BC薄膜的产率R(g/L)为：

(2)

1.5BC薄膜的表征

傅里叶变换红外光谱：KBr压片。

扫描电镜：放大倍数10 k倍。

X-射线衍射仪：扫描范围为5°～40°，Cu靶，管流40 mA，管压40 kV。

热重：温度范围为30～600 ℃，N2气氛，升温速率为10 ℃/min。

1.6衍生化[8]和凝胶色谱分析

取BC粉末0.10 g至50 mL烧瓶中，加1.25 mL三氟乙酸(TFA)和0.4 mL三氟乙酸酐(TFAA)，常温下搅拌2.5 h后得到透明的高粘度溶液，然后向内加3 mL的氯仿稀释，常温下放置10 h，用二乙醚100 mL洗涤，得到白色聚合物，在室温下80 Pa放置15 h后，于150 ℃，80 Pa干燥20 min除去二乙醚和TFA，得纯细菌纤维素三氟乙酸酯(CTFA)。用色谱纯的0.5 mL四氢呋喃(THF)溶解CTFA0.15 g，过滤后进样。标样为聚苯乙烯，色谱柱为聚苯乙烯凝胶柱，保留时间为15 min，柱温为45 ℃，流速为1 mL/min。

2　结果与讨论

2.1BC膜的制备

采用静态发酵的培养方法制备BC，以木醋杆菌Acetobacter xylinum为菌种，以椰子水为主要培养体系，制备的BC经碱溶液处理洗涤后得纯的BC凝胶膜，冷冻干燥得BC干膜。

2.2持水率测试

以蔗糖为碳源合成的BC(样1)的持水率为141%，而以半乳糖醛酸为碳源合成的BC(样2)的持水率是107%，持水率有所下降，但两者都具有非常高的持水率,这首先是因为BC是经木醋杆菌细胞壁分泌到液体培养基中大量聚集在一起形成的, 以此形成的膜会包裹大量的水分；其次，由于纤维素具有很好的三维网状结构，间隙的内表面积很大, 可以吸收大量的水分。

2.3BC的产率

样1的产率为5.45 g/L，而样2的产率下降的比较多为1.75 g/L。可能是加入的半乳糖醛酸被木醋杆菌代谢的比较慢，阻止了大规模发酵系统的进行。

2.4BC的表征

2.4.1傅里叶变换红外光谱分析

图2所示为样1和样2的红外谱图，由于BC结构中含有许多羟基，所以在3354.8 cm-1处的-OH伸缩振动的吸收峰显著，2896 cm-1处为亚甲基-CH2的对称伸缩振动峰，1060 cm-1处为C-O的伸缩振动峰。899 cm-1为糖苷键的特征吸收峰。对照两个图的红外特征峰，几乎完全一至，说明它们的产物在结构上是一样的。

图2　BC的红外谱图

2.4.2扫描电镜表征

图3为BC的扫描电镜图，从图中可以看BC有很好的三维网状结构，因其结构所以具有很强的吸湿性能和很好的机械性能，但添加半乳糖醛酸的样2具有超微细网状结构, 由高密度微纤维相互缠绕,形成微纤维，看起来致密性比较好，所以持水率没有样1的高。

图3　BC的扫描电镜图

2.4.3X-射线衍射仪测试

图4所示为样1和样2的X-射线衍射峰，在14.5°，16.9°，22.7°三处都有明显的衍射峰，因样品量不同而强度不同，但衍射峰的峰型是一样的，且在22.7°处的衍射峰最强。用JADE5.0软件[9]计算产物的结晶指数，样1的结晶指数为96%，而样2的为92%，有稍微降低。

图4　BC的X-射线衍射谱图

2.4.4热重分析

图5所示为样1和样2的TG谱图，由图可知，添加半乳糖醛酸的BC的热分解温度降低，添加蔗糖的BC到550 ℃已经几乎全部分解，但添加半乳糖醛酸的BC到600 ℃还有20%的量未分解，可能该BC中含有一些难分解的成分。TG的失重百分比及DTG的最大失重温度点列于表1。由表1可见，添加半乳糖醛酸后，产物的最大失重温度较纯BC要低30 ℃左右，失重百分比也有下降趋势。但不同比例的半乳糖醛酸的添加其失重百分比差别不大。

图5　BC的热失重曲线图

表1　BC的热稳定性

2.4.5凝胶色谱测试

BC是高分子化合物，常规其分子量的测定一般是先用DMAc/LiCl溶解[10]，然后用乌氏粘度计测定，但此种方法只能粗略得到聚和度及粘均分子量。而凝胶色谱(GPC)是比较常用

的测定分子量的方法，样品用有机溶剂溶解或水溶解。但BC很难溶于一般的有机溶剂或水，所以只有将BC进行衍生化，通过测定衍生化产物的分子量而推测BC的分子量。

分别将样1与样2衍生化后，溶解于THF，GPC测试结果如表2所示，添加半乳糖醛酸所得产物的纤维素三氟乙酸酯的分子量降低了10万左右，相对分子质量分布指数增大。

表1　衍生化产物的分子量及分布

3　结　论

以椰子水为主要培养体系，在生物合成BC过程中添加半乳糖醛酸，半乳糖醛酸的添加使产物的结构及微观结构没有太大差别，但产物的产率、持水率及结晶指数有所下降，热稳定性也稍微变差，但乳糖醛酸的添加却大大降低了BC的分子量，所以半乳糖醛酸有望作为碳源来合成低分子量的细菌纤维素。

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A Method for Reducing Bacterial Cellulose Molecular Weight*

ZHANGMing-nan1，LIUHai-fang2，LIYu-jie1，FENGYu-hong1

(1 Material and Chemical College of Hainan University, Hainan Haikou 570228;2 People’s Hospital of Hainan University, Hainan Haikou 570208, China)

Using coconut water as incubating system by adding galacturonic acid, bacterial cellulose (BC) were prepared by static fermentation culture method usingAcetobacterxylinumwhich was screened in our own laboratory. The structure and performance of BC were studied. Results showed the yield of BC, water-holding performance and the thermal decomposition behavior declined, and the structure characteristics and the crystallization properties were very little difference with adding galacturonic acid, but the product molecular weight was lower, about 100000 or so, galacturonic acid instead of sucrose as carbon source can produce bacterial cellulose of low molecular weight.

bacterial cellulose; galacturonic acid; low molecular weight

海南省自然科学基金(213011)；海南省教育厅基金项目(Hjkj2013-06)。

张名楠(1978-)，女，高级实验师，硕士，主要从事生物高分子的合成研究工作。

冯玉红(1969-)，女，博士，教授，主要从事生物材料的研究。

TQ352.79,Q539.3

A

1001-9677(2016)05-0061-03