黄瓜香水提取物对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的影响*

谢叶青，李春艳，侯思雨，黄　乐，孟海风，吴远铭

(1 吉首大学医学院，湖南　吉首　416000；2 吉首大学医学机能学教研室，湖南　吉首　416000)



黄瓜香水提取物对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的影响*

谢叶青1，李春艳2，侯思雨1，黄乐1，孟海风1，吴远铭1

(1 吉首大学医学院，湖南吉首416000；2 吉首大学医学机能学教研室，湖南吉首416000)

探讨黄瓜香对肝纤维化大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及生长转化因子β1(TGF-β1) 表达的影响。将 48只大鼠随机分为正常对照组、模型组、生理盐水组和黄瓜香干预组,分析仪检测血清ALT、AST、ALP、HA、LN、PCⅢ型胶原，HE染色显示肝的显微结构，SABC法免疫组织学染色显示 α-SMA及 TGF-β1。结果表明：与模型组和生理盐水组比较, 黄瓜香组ALT、AST、ALP、HA、 LN、PCⅢ型胶原含量均明显降低(P<0.01)；黄瓜香干预组有较正常肝小叶结构,少见纤细的纤维间隔,有炎性细胞少量浸润；模型组、正常对照和黄瓜香干预组α-SMA及TGF-β1表达的平均灰度值比较均有显著性差异(P<0.01)。黄瓜香可明显减少纤维化组织面积,其在治疗肝纤维化方面有开发价值。

肝纤维化；黄瓜香；α-平滑肌肌动蛋白；生长转化因子β1；大鼠

肝纤维化(hepatic fibrosis)是机体对慢性损伤的一种修复性反应，病理学基础主要涉及肝内细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)大量异常地沉积。现认为肝纤维化早期有逆转的可能，因而促进了天然药物抗肝纤维化的研究，在前期黄瓜香的实验探讨中，显示了其一定的保肝护肝作用[1]。因此，通过免疫组化法检测经典的CCl4诱导的肝纤维化模型大鼠肝组织中的TGF-β1和α-SMA的表达,研究黄瓜香对肝纤维化的影响作用。

1　实验材料与实验方法

1.1实验试剂

黄瓜香(Viola diffusa Ging，VDG)来源堇菜科堇菜属蔓茎堇菜的全草，采自湖南湘西，由湘西民族医药研究室提供鉴定；CCl4为中国联化化工试剂有限公司上海制造，分析纯，批号20041022；95%医用乙醇；ALT试剂盒, 批号 010021；AST

试剂盒, 批号020071；ALP试剂盒,批号030261,以上均购自于北京中生北控生物科技股份有限公司。 HA、LN、PCⅢ 肝纤维化酶联免疫试剂盒，鼠抗α-SMA单抗、兔抗TGF-β1单抗、SABC二抗试剂盒、DAB显色试剂盒均由武汉博士德生物公司提供。

1.2分组及取材

48只雄性清洁级Wistar大鼠, 质量(180±20) g,由中南大学实验动物学部提供，实验分为4组即模型组、正常对照组、生理盐水组和黄瓜香药物组，每组12只，将CCl4与豆油配成60%的浓度, 生理盐水组、模型组和药物干预组皮下注射，大鼠下腹区左右交替进行, 首剂0.2 mL, 以后每3～4天注射1次, 剂量为0.1 mL, 饮用10%乙醇。实验时间共持续6周[2]。正常对照组同上操作，饮用纯净水，皮下注射豆油，在造模同时，正常对照组及生理盐水组0.9%NaCl灌胃，药物干预组给予0.75 g/mL黄瓜香水提物灌胃1 mL/100 g,每天1次。

最后1次操作后大鼠全部禁食不禁水，2天后处死取肝脏切片，病理学检查。HE、免疫组化染色观察。腹主动脉取血,静置, 3500 rpm离心15 min分离血清, 4 ℃冷藏备用。

1.3肝脏形态学观察和HE染色观察

观察大鼠肝脏的表面光滑程度、颜色、质地,结节有无等。切片观察肝小叶结构状态、肝板排列情况、中央静脉胶原纤维的变化等。

1.4大鼠肝功能及血清肝纤维化指标检测

血清4 ℃冷藏备用，PCR检测 ALT、AST、ALP。ELISA测定大鼠血清中HA、 LN、PCⅢ型胶原，所有检测遵照试剂盒说明操作。

1.5α-SMA及 TGF-β1免疫组织化学染色和图像分析

SABC法免疫组化染色显示α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及生长转化因子β1(TGF-β1)每组选15张切片，放大倍数为200镜下选取1个视野，测定灰度值。

1.6统计学处理

采用均数±标准差表示，t检验统计分析，显著性差异P值<0.05，极显著性差异P值<0.01。

2　结　果

2.1黄瓜香对大鼠肝脏病理组织学的影响

图1　正常对照组大鼠肝组织 (HE染色 ×200)

图2　模型组大鼠肝组织 (HE染色 ×200)

图3　生理盐水组大鼠肝组织 (HE染色 ×200)

图4　干预组大鼠肝组织 (HE染色 ×200)

①正常对照组: 无异常病理改变，汇管区清晰可辨，有结构完整的肝小叶,无明显炎细胞浸润(图1);②模型组: 肝小叶界限模糊,胶原纤维包绕分割肝小叶, 多个点状或大片状坏死出现在小叶内、有部分肝细胞脂肪变性,汇管区见很多炎症细胞浸润(图2);③生理盐水组: 胶原纤维增生、坏死的范围和炎性细胞的浸润比模型组减少,但仍比较严重(图3);④药物组:肝小叶正常,少见纤细的纤维间隔, 炎性细胞浸润偶见(图4)。

2.2黄瓜香水提物对肝功能及血清肝纤维化指标的影响

模型组大鼠血清ALT、AST、ALP 活性较正常，对照组、生理盐水组和干预组显著升高(P<0.01),显示肝细胞被破坏，胞内酶大量溶出；药物干预组与生理盐水组比较，血清ALT、AST、ALP活性显著降低(P<0.01),与对照组比较,模型组HA、 LN、PCⅢ 含量，显著增加(P<0.01),说明造模成功,黄瓜香干预组与模型组比较,血清HA、 LN、PCⅢ 含量显著降低(P<0.01)。

表1　黄瓜香水提物对大鼠血清ALT、ALP、AST、 HA、 LN、PCⅢ的影响

注:与正常对照组和生理盐水组比较,★P<0.01,与模型组比较,▲P<0.01。

2.3黄瓜香水提物对肝细胞α-SMA及 TGF-β1表达的变化

免疫组化染色α-SMA及 TGF-β1阳性者棕黄色。正常对照组血管壁上有少许棕黄色的着色颜色浅。模型组肝小叶结构被破坏,肝细胞索紊乱,着色明显增多色深。生理盐水组与模型组接近。药物干预组有少量着色,且着色明显较模型组变淡。

表2各组大鼠肝组织α-SMA、TGF-β1免疫组化检测结果

Table 2　The expression of α-SMA and TGF-β1 in rats

组别例数α-SMATGF-β1正常对照组12102.4±28.7113.2±29.4模型组10153.2±21.1★161.2±20.6★生理盐水组12112.5±19.5122.6±38.5干预组11131.7±26.4▲△149.1±21.2▲△

注：与正常对照组比较,★P<0.01;与模型对照组比较,▲P<0.01;与生理盐水组比较,△P<0.01。

3　讨　论

肝组织α-SMA表达以及血浆TGF-β1变化是肝纤维化发生发展过程中的重要风向标，肝纤维化是多种原因引起的纤维结缔组织在肝脏内增生,细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)的合成增多降解减少，致使肝内细胞外基质过度沉积的病理过程。研究认为肝纤维化形成以肝细胞坏死和慢性炎症为前提;炎性介质激活肝脏枯否氏细胞(Kupffercells,KC)释放大量细胞因子和活性氧为中间环节;继之肝星状细胞(Hepaticstellatecells,HSC)被激活,合成以胶原为主的ECM沉积于肝组织等三个阶段。其中枯否氏细胞是肝纤维化形成过程中肝脏炎症反应的效应细胞,而肝星状细胞的活化是肝纤维化关键事件。因此干预HSC的生物学行为能成为成功防治肝纤维化的有效手段[3-4]。

生长转化因子(TGF-β1)是目前已知的最强的致纤维化多功能的细胞因子,强烈地影响着和肝星状细胞和肝细胞的生物学性状[5-6]。基于生长转化因子与肝纤维化息息相关,因此有效干预生长转化因子(TGF-β1)的表达，有良好的延缓和逆转纤维化的作用。

黄瓜香(VDG)为多年生草本植物，来源于堇菜科堇菜属蔓茎堇菜的全株入药，鲜草揉碎后有较强烈的黄瓜气味而得名，全草有清热解毒，消肿排脓之功，主治肝炎。本实验应用黄瓜香灌胃治疗四氯化碳造模成功的肝纤维化的模型大鼠,证实对肝纤维化的大鼠有很好的保护作用。其机理可能与黄瓜香能抑制α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及生长转化因子β1(TGF-β1)的表达有密切的关系。

4　结　论

肝脏疾病为常见的影响人类健康的疾病之一，目前以中医药科研新成果阻断、逆转肝纤维化已成为一个新的有效治疗方法。较理想的抗肝纤维化药物应具有良好耐受性，对肝脏有特异的靶效应，无毒或低毒，天然药物及中草药在这方面具有得天独厚的优势，黄瓜香对α-SMA及TGF-β1的表达有一定的抑制作用，能明显减少纤维化组织面积，降低肝损伤的程度，证实了其良好的保肝护肝作用。

[1]李先辉,李春艳,吕江明,等.黄瓜香水提物体外抗氧化活性实验[J].吉首大学学报,2006,27(5):95-97.

[2]刘恒兴,邵锋,王环震,等.β-2胡萝卜素对肝纤维化大鼠肝组织 α-平滑肌肌动蛋白和转化生长因子β1表达的影响[J].新乡医学院学报,2008,25(1):5-7.

[3]Schoemaker MH,Ros J E,Homan M, etal. Cytokineregulation of pro-and anti-apoptotic genes in rat hepatocytes: NF-kappaB regulated inhibitor of apoptosis protein2(cIAP2) prevents apoptosis[J].Journal of Hepatology,2002,36(6):742-50.

[4]翁榕安,李先辉,李春艳.黄瓜香提取物对实验性肝纤维化大鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及生长转化因子β1表达的影响(J).食品科技,2010,35(8):271-277.

[5]Sanz S, Pucilowska JB,Liu S, et al. Expression of insulin-like growth factorⅠby activated hepatic stellate cells reduces fibro-genesis and enhances regeneration after liver injury[J]. Gut,2005,541:134-141.

[6]吴繁荣,陈飞虎,胡伟.鬼针草总黄酮对免疫性肝纤维化大鼠胶原代谢的影响及机制[J].中国药理学通报,2012,28(4):504-7.

The Effect of VDG on Hepatic Fibrosis by Carbon Tetrachloride in Rats*

XIEYe-qing1,LIChun-yan2,HOUSi-yu1,HUANGLe1,MENGHai-feng1,WUYuan-ming1

(1 College of Medicine, Jishou University, Hunan Jishou 416000;2 Staff room of function, College of Medicine, Jishou University,Hunan Jishou 416000, China)

The effects of VDG on the expression of smooth muscle actin alpha(α-SMA) and transforming growth factor-β1(TGF-β1)in rats with hepatic fibrosis were studied. Forty-eight rats were randomly divided into four groups: normal control group, model control group, normal sodium group and interrupt group. The contents of ALT, AST, ALP, HA, LN and PCⅢ were measured by full automatic biochemical analyzer and ELISA, hepatic microstructure was showed by HE staining,the expression of α-SMA and TGF-β1was showed by immunohistochemistry dyeing. Compared with the model group, the contents of ALT, AST, ALP, HA、LN and PCⅢ remarkably decreased(P<0.01). In interrupt group, the hepatic lobe structure was normal, the slender textile fiber gap was minority, and there was the few inflammatory cell infiltration. There was significant difference in the average grey degree of α-SMA and TGF-β1among normal control group, model control group and interrupt group (P<0.01). The alcohol extract from VDG showed the protective effects for liver fibrosis and could alleviate the degree of degeneration and necrosis induced by CCl4.

hepatic fibrosis; viola diffusa ging; smooth muscle actin alpha; transforming growth factor-β1; Rats

吉首大学大学生研究性学习与创新性实验计划项目(No：教通[2014]34号)；吉首大学2015年度医学类专业大学生创新训练项目(No: JDYXCX201512) ；吉首大学2015年度医学类专业大学生创新训练项目(No: JDYXCX201510)。

谢叶青(1994-)，女，吉首大学医学院2012级临床医学本科。

李春艳(1965-)，女，教授，研究方向：天然药物药理。

R285.5

A

1001-9677(2016)02-0054-03