纳米SiO2暴露对大鼠空间学习记忆及海马齿状回长时程增强的影响*

孙焕瑞， 张　娜， 陈学伟， 安改红， 徐传香， 马　强

(1. 军事医学科学院卫生学环境医学研究所， 天津 300050； 2. 天津体育学院， 天津 300381)



纳米SiO2暴露对大鼠空间学习记忆及海马齿状回长时程增强的影响*

孙焕瑞1,2， 张娜1△， 陈学伟1， 安改红1， 徐传香1， 马强1△

(1. 军事医学科学院卫生学环境医学研究所， 天津 300050； 2. 天津体育学院， 天津 300381)

目的：探讨纳米二氧化硅(nano-SiO2)对大鼠学习记忆能力的影响。方法：24只雄性SD大鼠随机分为3组(n=8):即对照组(C组)，低剂量组(L组)和高剂量组(H组)。采用灌胃给药4周，干预组给予nano-SiO2颗粒混悬液，L组和H组给予剂量分别为25 mg/kg和100 mg/kg体重，对照组给予同等剂量生理盐水。每周测大鼠体重，利用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力；在体脑立体定位电生理法检测大鼠海马齿状回LTP。结果：H组体重增幅较C组显著减小(P<0.05)，L组体重增长与C组相比有减小趋势，但无统计学意义；H组大鼠在定位航行实验中逃避潜伏期明显长于同时期C组(P<0.05)，而空间探索实验中目的象限游泳时间明显低于C组(P<0.05)；H组LTP诱导率显著低于C组(P<0.05)，高频刺激(HFS)前，组间PS峰幅值无显著差异，HFS后，L组和H组PS峰增幅均显著低于C组(P<0.05，P<0.01)。结论：nano-SiO2可能通过降低大鼠海马齿状回LTP的诱导和PS峰的增幅，进而影响大鼠学习记忆能力。

纳米SiO2；学习记忆；长时程增强现象；海马；大鼠

随着纳米科技的发展，纳米材料作为一种新型材料被广泛应用于机械、纺织、军工、化妆品、家用电器、医药和化工等众多领域。纳米二氧化硅(nano-SiO2)是纳米材料中的重要一员，粒径小于100 nm，具有化学纯度高、分散性能好、比表面积大等特点，是目前国际和国内大规模工业化生产产量最高的一种纳米粉体材料[1]。因其独特的光、电、磁学等性能，在橡胶、塑料、涂料、纤维等领域有着广泛的应用，这就进一步增加了生产者、研究者、生产经营者和普通消费者接触纳米材料的机会[2]，因而其安全性也日益受到人们的关注。研究发现，纳米颗粒可穿越血脑屏障进入大脑[3],也可以通过嗅神经途径进入中枢神经系统[4]，并转至不同脑区沉积，造成脑组织的损害，但其对学习记忆的影响机制鲜有研究报道。因此本研究将观察nano-SiO2对大鼠空间学习记忆行为的影响，并探讨其可能机制，有助于为预防由nano-SiO2引起的神经疾病提供科学依据。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组

健康SD大鼠24只,体重160～180 g[由军事医学科学院动物中心提供，动物许可证号SCXK-(军) 2002-001]，随机分为对照组(C组)、低剂量组(L组)和高剂量组(H组)(n=8)。实验动物饲养于清洁的不锈钢饲养笼内，大鼠可以自由摄食和饮水，动物房温度18℃～24℃、湿度50%,相对较为恒定，每天12 h光照∶12 h黑暗(光照时间6∶00～18∶00)。采用灌胃给药方式处理4周，干预组给予纳米二氧化硅颗粒混悬液2 ml，对照组给予同等剂量生理盐水。给药前混悬液震荡5 min，以防止纳米颗粒物沉淀或聚沉。干预组给予纳米颗粒物剂量为低剂量组(25 mg/kg)和高剂量组(100 mg/kg)。时间为4周，每周测量体重。

1.2药品与器材

nano-SiO2(上海润河纳米研究科技有限公司)，水迷宫行为学检测箱(自制)，脑立体定位仪(上海江湾)，电刺激器(日本光电)，生物电放大器及示波器(丹麦丹迪)。

1.3Morris 水迷宫测试

定位航行试验：装置为直径150 cm圆形水池，分为4个象限，水温20℃±2℃。将10 cm x 10 cm的透明站台，放于任一象限的中央，站台隐蔽于水面下1～2 cm。将大鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个象限起始位置之一。实验连续4 d，每天训练4次，记录动物寻找并爬上平台所需时间(即逃避潜伏期)。1 min内寻不到平台者，将其引至平台，逃避潜伏期记为60 s。动物爬上平台后在平台上停留15 s。一次训练结束后间隔15～20 min，进行下一次训练，每次训练完成后迅速将动物擦干放入笼中。

空间探索实验：第5天将水下平台撤掉，任选一象限作为入水点，使动物在水中自由游泳3 min，记录3 min内动物在目的象限(原平台象限)的游泳时间。实验时，水池周围参照物(包括实验人员所站的位置)保持不变。

每天在固定时间测试，操作轻柔，避免不必要的应激刺激对实验结果造成影响。由于应激反应游泳过程中会造成大鼠排便，应定期换水以免水腐败变质。在实验干预前，对所有组别实验动物的各项行为学制表的基线值进行了测验，各组动物的行为指标无差异。

1.4LTP的测定

采用20%乌拉坦腹腔注射(1.5 ml/kg)，待动物麻醉后，置于脑立体定位仪上定位。记录电极定位于海马的齿状回(前囟后3.5 mm，中缝旁2.0 mm，硬脑膜下3.5 mm)，刺激电极定位于同侧海马穿行通路上(前囱后8.0 mm，中缝旁4.0 mm，硬脑膜下3.0 mm)，通过电刺激器先行单刺激(间隔30 s，每刺激时程200 μs)，用神经肌电仪记录群峰电位(population spike,PS)，然后调节刺激强度使PS保持在最大峰值的70%。此时开始记录，由记录仪自动记录每5 min内引出10个PS的平均值，共记录30 min，然后应用高频刺激以诱发长时程增强现象(long term potentiation, LTP)。在2 s内给予高额刺激(HFS)10串(每串含5个刺激，每个刺激时程200 μs)，串间隔5 ms。待LTP产生后，再改用单刺激，同样记录每次5 min内10个PS的平均值，记录60 min。HFS后PS电位幅值用百分比表示。一般情况下，HFS后，与刺激前相比，PS峰(图1 PS=(a+b)/2)增高在30%以上，且可维持至少30 min，一般认为是LTP[5]。

Fig. 1The latitude of population spike

1.5数据处理

2　结果

2.1nano-SiO2对大鼠体重的影响

经过4周nano-SiO2灌胃处理，分别记录每周平均体重并计算涨幅。结果显示：L组涨幅与C组相比无显著性差异，但有减小趋势，随着nano-SiO2浓度的增加，H组体重涨幅均值显著低于C组(P<0.05,图2)。

C: Control group; L: Low dose group; H: High dose group

*P<0.05vsgroup C

2.2nano-SiO2对大鼠Morris水迷宫测试的影响

2.2.1nano-SiO2暴露对大鼠水迷宫定位航行实验逃避潜伏期的影响水迷宫定位航行实验显示，随着训练天数和次数的增加，各组大鼠的逃避潜伏期均有缩短。nano-SiO2干预组逃避潜伏期较C组均有增高，其中H组显著高于C组(P<0.05，图3)。

Fig. 3Effects of nano-SiO2exposure on escape latency of rats in Morris water maze place navigation

*P<0.05vsgroup C

2.2.2nano-SiO2暴露对大鼠水迷宫空间探索实验目标象限游泳时间的影响目标象限(原平台象限)游泳时间实验结果显示：L组大鼠目标象限游泳时间较C组有降低趋势，H组则显著低于对照组(P<0.05，图4)。

Fig. 4Effects of nano-SiO2exposure on rat swimming time in target quadrant in Morris water maze place navigation

*P<0.05vsgroup C

2.3HFS后各组间海马齿状回诱发电位的比较

2.3.1各组间LTP诱导率HFS后，C组有6只诱导出LTP，诱导率为75%；L组有3只诱导出LTP，诱导率为37.5%；H照组有2只诱导出LTP，诱导率为25%。其中L组与C组相比，差异没有统计学意义；H组的诱导率较C组显著降低(P<0.05)。

2.3.2各组间PS幅值变化的比较高频刺激(HFS)前，各组的PS峰幅值无显著性差异。HFS后，PS峰值增加幅值明显升高(图5)，出现LTP。与C组比较，L组的PS峰升幅较小，差异有统计学意义(P<0.05)；H组的PS峰增幅较小，与C组相比，差异具有统计学意义(P<0.01，图6)。

Fig. 5Comparison of PS after HFS

A: C group; B: L group; C: H group

Fig. 6Effects of nano-SiO2exposure on the LTP in DG of rats

LTP: Long-term potentiation

*P<0.05，**P<0.01vsgroup C

3　讨论

随着纳米技术的不断发展，纳米材料的广泛应用，人们接触纳米材料及纳米颗粒的机会大大增加，有关纳米材料对人体的危害日益受到关注。大脑中血脑屏障可以阻止异物进入脑内，起到保护作用。但有研究报道，由于尺寸小和高表面活性，纳米材料可跨越血脑屏障，从而影响到学习记忆功能。

Morris水迷宫[6]是1989年英国生理学家Morris发明并被用于学习记忆脑机制的研究，是用于啮齿类动物空间学习记忆的重要评估工具。叶翠飞等[7]利用水迷宫实验和神经电生理实验加以验证，得出匹拉西坦可以改善痴呆大鼠的学习记忆功能。本实验中选用纳米SiO2观察其对大鼠空间学习记忆功能的影响，随着浓度的增加，定位航行实验逃避潜伏期延长，空间探索实验目标象限游泳时间降低，提示纳米二氧化硅可能导致大鼠空间学习记忆能力下降。

海马作为与学习记忆以及行为情绪高度相关的重要脑区，海马区神经元间的突触联系以及可塑性是学习记忆的基础，其功能的高低直接反映了学习记忆的好坏。海马LTP是高频刺激，刺激传入纤维所引起的突触传递效能的持续性增强。一般认为，一定频率的高频刺激一方面促进了突触前膜谷氨酸递质的大量释放，另一方面使突触后膜去极化，从而逐步解除堵塞突触后膜NMDA受体通道的Mg2+。这样当递质与受体结合后，通道开放，Ca2+内流，胞内Ca2+浓度升高，继而触发一系列生化反应(如激活蛋白激酶C和Ca2+/钙调蛋白激酶)，改变膜的性质，导致LTP的产生[8]。

海马内诱导出的LTP多被作为研究学习记忆行为的电生理指标。Barnes等[7]通过实验证明衰老大鼠在旋转平台上的空间学习辨别能力明显低于青年大鼠，同时记录到的LTP幅度也小于青年大鼠。因此本研究观察了nano-SiO2暴露后大鼠在体海马齿状回LTP的诱导情况。结果显示nano-SiO2致大鼠LTP诱导率下降及PS峰涨幅下降、空间学习记忆行为受损。安磊等[9]给予大鼠nano-CuO灌胃后发现纳米氧化铜可进入大鼠海马中，与对照组相比，发现海马内细胞形态发生改变，水迷宫逃避潜伏期变长，游泳速度降低，在体LTP实验显示LTP引出率下降，PS幅值降低。另外还有研究表明，nano-Ag也可进入海马组织对大鼠的空间学习记忆功能以及在体LTP产生同样的影响[10]。这与本研究结果相一致。

本实验中大鼠经不同浓度nano-SiO2暴露后其在体诱导的PS峰增幅减小，LTP引出率下降，可能是由于nano-SiO2影响了突触前递质的释放量，或改变了突触后膜去极化的阈值，影响后膜内Ca2+的浓度和蛋白激酶C的活性等。目前，本实验仅开展了行为学和电生理学的实验，我们将会进行生化等方面的检测来做出进一步解释。

LTP是应用电生理方法在突触水平来研究动物学习记忆能力的一种有效方法，被认为是研究学习记忆的经典模型。根据本实验的结果可以推测，nano-SiO2引起LTP表达受损的某些神经细胞突触过程可能参与学习记忆行为受损过程，从而引起大鼠学习记忆能力下降。

[1]Qhobosheane M, Santra S, Zhang P,etal. Bioehemieally funetionalized silica nanoparticles[J].Analyst, 2001, 126(8): 1274-1278.

[2]Masciangioli TM, Zhang WX. Environmental Technologies at the nanoscale：potential & pitfalls[J].EnvironmentalScienceandTechnology, 2003, 37(5): 102-108.

[3]Bliss TV, Collingridge GL. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus[J].Nature, 1993, 361(6407): 31-39.

[4]Wang B， Feng WY, Zhu MT，etal. Neurotoxicity of low-dose repeatedly intranasal instillation of nano- and submicron- sized ferric oxide Particles in mice[J].JNanopartRes, 2009, 11(1)：41-53.

[5]李永新, 梅镇彤. 长时程增强的形成机制及其与学习记忆相关性[J]. 生理科学进展， 1993, 24(3): 278-280.

[6]Morris RGM. Developments of a water-maze proceduce for studying spatial learning in the rat[J].NeurosciMethods, 1984, 11(1): 47-60.

[7]叶翠飞， 张丽. 两种水迷宫实验对拟痴呆模型动物学习记忆功能测试的比较[J]. 中国行为医学科学， 2004, 13(3): 252-253.

[8]Barnes CA. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat [J].JCompPhysiolPsychol, 1979, 93(1): 74-104.

[9]An L, Liu S, Yang Z. Cognitive impairment in rats induced by nano-CuO and its possible mechanisms[J].ToxicolLett, 2012, 213(2): 220-227.

[10]Liu Y, Guan W, Ren G. The possible mechanism of silver nanoparticle impact on hippocampal synaptic plasticity and spatial cognition in rats[J].ToxicolLett, 2012, 209(3): 227-231.

Effect of nano-SiO2exposure on spatial learning and memory and LTP of hippocampal dentate gyrus in rats

SUN Huan-rui1,2, ZHANG Na1△, CHEN Xue-wei1, AN Gai-hong1, XU Chuan-xiang1, MA Qiang1△

(1. Institute of Health and Environmental Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin;2. Tianjin University of Sport, Tianjin 300381, China)

Objective: To study the effect of nano-SiO2on spatial learning and memory. Methods: Twenty-four male rats were randomly divided into 3 groups: control group (C group), low dose group (L group) and high dose group (H group). The rats were intragastrically administrated with nanometer particles at 25 and 100 mg/kg body weight every day for 4 weeks. After exposure, the ability of learning and memory of rats was tested by Morris water maze, and electrophysiological brain stereotactic method was used to test long-term potentiation (LTP) in dentate gyrus (DG) of the rats. Results: The increase rate of body weight in H group was reduced significantly compared with C group (P<0.05). In the space exploration experiment of Morris water maze test, the escape latency of H group was longer than that of C group (P<0.05). The rats of H group spent less time in finding the target quadrant (P<0.05). The rate of LTP induction of H group was significantly lower than that of C group (P<0.05). After high fre quency stimulation (HFS), The changes of amplitude of population spike (PS) of L group and H group were lower than those of C group significantly (P<0.05,P<0.01). Conclusion: Nano-SiO2may result in impairment of spatial learning and memory ability by reducing the rate of LTP induction and the increase of PS in hippocampus.

nano-SiO2；learning and memory；LTP；hippocampus；rats

2015-02-04

2015-06-12

△Tel：022-84655196； E-mail：magiangw@sina.com

R114

A

1000-6834(2016)01-078-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.020