有氧耐力训练对大鼠骨骼肌线粒体功能及PI3K-Akt蛋白的表达影响*

刘绍东， 张彦秋， 曹　江

(西安石油大学体育系， 陕西西安 710065)



有氧耐力训练对大鼠骨骼肌线粒体功能及PI3K-Akt蛋白的表达影响*

刘绍东， 张彦秋△， 曹江

(西安石油大学体育系， 陕西西安 710065)

目的：观察有氧耐力训练大鼠骨骼肌线粒体磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路的表达情况。方法：将36只大鼠随机分为3组(n=12)：对照组、有氧耐力训练组和一次性力竭组。分组干预结束后，检测各组大鼠骨骼肌线粒体膜电位(MMP)水平、琥珀酸脱氢酶(SDH)和细胞色素C氧化酶(COX)活性，利用Western blot法测定组织中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB或Akt)的磷酸化水平。结果：与对照组相比，一次性力竭组大鼠MMP、SDH和COX活性水平、磷酸化PI3K和磷酸化Akt蛋白水平明显降低(P<0.05)；而有氧耐力训练组大鼠上述指标均显著高于一次性力竭组(P<0.05)，与对照组比无明显差异。结论：有氧耐力训练对大鼠骨骼肌线粒体具有保护作用，其机制可能与活化PI3K-Akt信号通路有关。

有氧耐力训练；大鼠；骨骼肌；线粒体；PI3K-Akt信号通路

线粒体是细胞内氧化磷酸化和三磷酸腺苷合成的主要场所，因此也是机体完成各项生理活动所需能量的主要来源。骨骼肌细胞中含有丰富的线粒体，以满足运动时骨骼肌收缩所需要的能量。骨骼肌细胞线粒体有氧代谢能力的高低直接影响机体耐力素质的高低。目前研究已证实，规律开展的有氧耐力训练通过提高骨骼肌有氧代谢能力、肺组织有效气体交换量、心脏射血能力和血红蛋白携氧能力等因素提升机体有氧耐力[1-3]。此外，动物实验也证实，大鼠经过8～12周有氧耐力训练后，其骨骼肌线粒体数目明显增加，线粒体中SOD活性显著升高，线粒体呼吸控制比也明显增加[4,5]。

尽管线粒体在有氧耐力训练提升骨骼肌运动耐力中发挥如此重要的作用，但是有氧耐力训练发挥线粒体保护作用的具体机制仍未明确，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信号通路作为经典的存活通路是否参与其中也尚无研究证实。因此，本研究拟利用动物实验检测有氧耐力训练对一次力竭运动诱导骨骼肌线粒体功能异常的影响，以及该过程中PI3K-Akt信号通路的活化情况。

1　材料与方法

1.1材料

由西安交通大学实验动物中心选购健康清洁级6周龄雄性SD大鼠36只(体重170～210 g)和相应的饲料；BW-ZH-PT型动物跑台购自上海软隆科技发展有限公司；兔抗大鼠p-PI3K抗体和兔抗大鼠p-Akt抗体购自美国Cell signaling公司，兔抗大鼠β-actin抗体购自Santa Cruz公司；RIPA组织总蛋白提取试剂盒购自西安先锋生物科技有限公司；常规试剂均为国产分析纯。

1.2分组和干预

适应性喂养1周后，将所有大鼠随机分为3组：对照组(Control)、有氧耐力训练组(ET)和一次性力竭组(NET)(n=12)。其中有氧耐力训练组在长0.6 m、宽0.4 m、深0.5 m的水池内进行游泳运动，水池内水温稳定在35℃左右，运动时间为每周5 d，每天运动时间逐周递增，第一周，1 h/d；第二周，1.5 h/d；第3～8周，2 h/d，每周运动5 d。对照组和一次性力竭组不予任何处理。有氧耐力训练8 周结束后，有氧耐力训练组和一次性力竭组大鼠均进行一次持续下坡跑力竭运动，具体运动方法参考罗吉伟等人所用方法[6]。三级运动负荷分别为0°×8.2 m/min×15 min(相当于53% VO2max)、5°×15 m/min×15 min(相当于64% VO2max)、10°×19.3 m/min(相当于74%VO2max)持续至力竭，力竭判断标准为大鼠停滞于跑到后1/3处达3次以上，声、光、电等刺激无效。

1.3样品采集和处理

干预结束时，立即断头处死各组大鼠，迅速取左后肢股四头肌中间部分，用4℃磷酸盐缓冲液冲洗干净后用于提取总蛋白和线粒体。总蛋白提取方法如下：在冰上将骨骼肌组织剪碎后，加入RIPA裂解液，于玻璃匀浆器中冰上匀浆15 min左右，将全部匀浆液快速转移至离心管，10 000 r/min离心15 min，收集上清液，即为总蛋白，保存于-80℃冰箱中备用。

1.4线粒体提取

采用动物组织/细胞活性线粒体分离试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)，按照说明书操作步骤提取骨骼肌组织线粒体。将分离所得线粒体提取物保存于-80℃冰箱中备用。

1.5膜电位测定

将新鲜分离得到的骨骼肌组织线粒体用500 μl的JC-1工作液(碧云天生物技术有限公司)重悬，放入37℃水浴箱中孵育20 min，1 000 r/min离心20 min，弃上清，用磷酸盐缓冲液充分洗涤2次，加入500 μl缓冲液重悬线粒体，于荧光酶标仪上检测线粒体膜电位水平。分别以585 nm和514 nm波长的激发光激发荧光，记录红色、绿色荧光强度，两者的比值即代表线粒体膜电位水平。

1.6酶活性测定

采用动物组织线粒体SDH活性检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)和线粒体COX活性测定试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)，按照说明书操作步骤测定骨骼肌组织线粒体提取物中SDH和COX的活性。所有实验均重复3次，样本量均为5。

1.7Western blot

采用BCA法测定蛋白浓度，取等质量的骨骼肌总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以湿转法将蛋白转移到PVDF膜，随后用5%脱脂奶粉在室温下封闭处理2 h，并分别用抗p-PI3K抗体(1∶500)、抗p-Akt抗体(1∶1 000)或β-actin单克隆抗体(1∶4 000)4℃孵育过夜，用含Tween-20的磷酸盐缓冲液洗涤后，在室温下加入生物素标记的山羊抗兔抗体室温下孵育2 h，再次充分洗涤，用ECL法显影，在Image-Pro Plus软件中分析各蛋白条带的积分吸光度值，以3次重复检测所得平均值代表该组的目的蛋白表达水平，样本量为5。

1.8统计学分析

2　结果

2.1大鼠骨骼肌线粒体功能检测结果

与对照组相比，力竭运动后一次性力竭组大鼠骨骼肌MMP、线粒体SDH和COX活性均出现明显的降低趋势，而有氧耐力训练组的上述三个指标均显著高于一次性力竭组(P<0.05，表1)，有氧耐力训练组和对照组无显著性差异。

Tab. 1The mitochondrial function of rats skeletal muscle among groups

GroupMMPSDHCOXControl100±2.03100±2.29100±2.35NET81.1±2.11*76±1.88*70.4±2.30*ET94.2±2.16#95.5±1.41#86.3±2.76#

MMP：Muscle mitochondrial membrane； SDH：Succinate dehydrogenase； COX：Cytochrome coxidase； NET：Non-endurance training group； ET：Endurance training group

*P<0.05vscontrol group；?#P<0.05vsNET group

2.2大鼠骨骼肌PI3K-Akt信号通路活化状态

与对照组相比，一次性力竭组大鼠骨骼肌组织中p-PI3K和p-Akt水平均明显降低，而有氧耐力训练组上述蛋白水平均显著高于一次性力竭组(P<0.05，图1)。说明有氧耐力训练可以显著改善大鼠抵抗一次力竭运动对PI3K-Akt信号通路活化的抑制作用。

Fig. 1Each group rats skeletal muscle PI3K - Akt signaling pathway related protein expression level

ET：Endurance training group； NET：Non-endurance training group

*P<0.05vscontrol group；?#P<0.05vsNET group

3　讨论

有氧耐力训练可以有效改善骨骼肌线粒体功能和细胞整体代谢活性，但其中的具体机制尚未明确[7，8]。PI3K-Akt信号通路具有促进细胞增殖、分化，抑制细胞凋亡和调节细胞内物质代谢的生物学作用，广泛参与肿瘤、神经系统退行性疾病和感染性疾病等的发生和发展过程[9-12]。近期Zhang等人在探索内质网应激调节心肌细胞线粒体功能时发现，毒胡萝卜素在诱发心肌细胞内质网应激的同时，抑制了Akt磷酸化过程间接诱导线粒体损伤，而夹竹桃麻素则可通过持续活化PI3K-Akt信号通路部分消除毒胡萝卜素诱导的线粒体膜电位降低和线粒体膜通透性转换孔开放[13]。艾春雨等人也发现控制性低压后处理活化PI3K-Akt信号通路参与其对抗兔缺血再灌注损伤脊髓线粒体结构和功能的保护作用[14]。袁磊等人在探究1-磷酸鞘氨醇(S1P) 对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞的保护作用及其分子机制中发现，S1P能够显著抑制缺氧/复氧引起的心肌细胞凋亡，其机制可能与S1P激活PI3K-Akt信号通路进而稳定线粒体膜电位有关[15]。此外，进一步研究还发现PI3K-Akt信号通路的下游分子糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β)的活化是该通路发挥保护线粒体结构完整性的主要机制[16]。

本实验利用大鼠游泳运动模拟有氧耐力训练，评价规律有氧耐力训练8周对机体抵抗一次力竭运动诱发线粒体损伤能力的影响。结果发现一次力竭运动可以造成骨骼肌线粒体膜电位和酶活性的降低，而持续8周的有氧耐力训练可以显著提高大鼠抵抗一次力竭运动造成线粒体损伤的能力，说明活化PI3K-Akt信号通路可能是有氧耐力训练保护骨骼肌线粒体功能的主要机制之一。研究证实，PI3K诱导Akt磷酸化而活化后，可以通过真核细胞翻译启动子4E结合蛋白1促进线粒体呼吸链的活性升高[17]，还可以通过促进胰岛素的促线粒体融合作用提高线粒体摄氧能力，还可能通过活化PI3K-Akt信号通路，诱导磷酸化的Akt向线粒体移位而发挥对线粒体乃至细胞整体的保护作用。Gautam等人发现IGF-1、胰岛素和多种应激因素均可迅速诱导Akt向线粒体移位和聚集，而且线粒体中聚集的Akt多数处于磷酸化的活化状态，磷酸化的Akt进入线粒体是PI3K-Akt信号通路直接调节线粒体功能的重要机制[18,19]。结合本实验结果，有氧耐力训练可能通过活化PI3K-Akt信号通路，继而启动上述机制发挥对骨骼肌线粒体的保护作用。

综上所述，有氧耐力训练可能明显提高机体抵抗一次力竭运动诱发线粒体损伤的能力，活化PI3K-Akt信号通路可能是有氧耐力训练保护骨骼肌线粒体功能的主要机制之一。

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The influence of the aerobic endurance training on the skeletal muscular mitochondria function and PI3K-Akt protein expression

LIU Shao-dong, ZHANG Yan-qiu△, CAO Jiang

(Physical Education Department of Xi’an Shiyou University, Xi’an 710065, China)

Objective: To determine the role of phosphatidylinositol 3-kinase - protein kinase B (PI3K-Akt) signaling pathway in the protective effect of aerobic endurance training on the skeletal muscular mitochondria. Methods: Thirty-six rats were randomly divided into three groups(n=12): control group, aerobic endurance training group and one-time exhaustive group. After the intervention，the quadriceps femoris muscle sample was obtained to detect the mitochondrial membrane potential(MMP), the activities of succinate dehydrogenase(SDH) and cytochrome coxidase(COX), and the protein levels of p-PI3K and p-Akt. Results: Compared with the control group, the levels of mitochondrial membrane potential, the activities of succinate dehydrogenase and cytochrome coxidase, and the protein levels of p-PI3K and p-Akt were all significantly decreased in the one-time exhaustive group(P<0.05). However, all the above was partially reversed in the endurance training group(P<0.05),and there was no obvious difference with the control group(P>0.05). Conclusion: Aerobic endurance training plays an important role in the protective effect on the skeletal muscular mitochondria, the mechanism may be related to activation PI3K-Akt signaling pathway.

aerobic endurance training;rat;skeletal muscle;mitochondria;PI3K-Akt signaling pathway

陕西省体育局常规课题基金资助项目(13044)

2015-01-30

2015-06-19

△Tel：15349218983； E-mail: zhangyq1115@163.com

G804.2

A

1000-6834(2016)01-055-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.014