吗啡依赖位置偏爱大鼠穿梭状态下内侧前额皮层的脑电特征*

李　晶， 潘群皖， 朱再满， 李　敏， 叶　政

(皖南医学院生理教研室， 安徽 芜湖 241002)



吗啡依赖位置偏爱大鼠穿梭状态下内侧前额皮层的脑电特征*

李晶， 潘群皖△， 朱再满， 李敏， 叶政

(皖南医学院生理教研室， 安徽 芜湖 241002)

目的：研究吗啡依赖位置偏爱大鼠穿梭状态下内侧前额皮层(mPFC)脑电特征与觅药行为的相关性。方法：将40只大鼠随机分为4组(n=10)：吗啡PL组、盐水PL组、吗啡IL组、盐水IL组。采用脑立体定位术在各组大鼠mPFC的边缘前区(PL区)或边缘下区(IL区)埋置电极，建立吗啡依赖条件性位置偏爱(CPP)大鼠模型，遥测分析各组大鼠建模前后穿梭时mPFC脑电各波百分比的差异。结果：吗啡PL组和IL组大鼠建模后戒断症状明显，在白箱活动时间和路程明显增加。吗啡PL组大鼠建模后与对照组相比，向白箱穿梭时，脑电δ波比例明显减少，β波比例明显增加；向黑箱穿梭时，上述脑波出现相反的改变。吗啡IL组大鼠建模后与对照组比较，向白箱穿梭时，脑电δ波比例明显增加，β波及α波比例明显减少；向黑箱穿梭时，各脑波比例与对照组相比无明显差异。结论：吗啡CPP大鼠穿梭状态下mPFC的PL区和IL区脑电改变不同，且向伴药箱穿梭与非伴药箱穿梭发生的脑电变化也不同，提示不同觅药环境线索在mPFC不同脑区产生的脑电改变可能存在不同机制。

吗啡依赖；条件性位置偏爱；内侧前额皮层；脑电；遥测；大鼠

吗啡等阿片类药物长期使用后，可使机体成瘾产生躯体和心理依赖，即成瘾者陷入强迫性觅药、用药，甚至戒断后复吸的恶性循环[1]。新近研究指出，药物成瘾的形成与内侧前额皮层(medial prefrontal cortex，mPFC) 相关脑区的功能异常紧密相关[2，3]，其背侧部的边缘前区(prelimbic cortex，PL)和腹侧部的边缘下区(infralimbic cortex，IL)参与成瘾有关的动机形成和调节过程[4,5]。本室通过立体定位脑内电极埋藏结合脑电遥测技术，在条件性位置偏爱(conditioned place preference，CPP)视频箱内，计测分析吗啡依赖CPP大鼠穿梭状态下mPFC不同脑区原始脑电活动的特异性改变，旨在进一步明确mPFC不同脑区在大鼠吗啡依赖形成中的作用及觅药环境线索对mPFC脑电活动和觅药行为的影响，该方面研究少见报道。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物筛选40只符合实验条件的SPF级雄性SD大鼠，体重(280～320)g，购自爱尔麦特科技有限公司〔合格证号：SCXK(苏)2009-0001〕。动物自由摄食、饮水，室温21℃～25℃，自然光照。将大鼠随机分成4组(n=10)：吗啡PL组、盐水PL组、吗啡IL组、盐水IL组。

1.1.2药品和仪器盐酸吗啡注射液(批号：110508-2)，沈阳第一制药厂；CPP视频分析系统(型号：JLBehv)，上海吉量科技有限公司；脑立体定位仪(型号：江湾2型)，第二军医大学；生理无线遥测系统(型号：BW-200)，成都泰盟科技有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠mPFC脑区电极埋藏经1%戊巴比妥钠腹腔麻醉后(5 ml/kg)，俯卧位固定大鼠于脑立体定位仪上(耳间线高于门齿杆3 mm，使前、后囟位于同一水平面)。术区剪毛、消毒，切开、剥离头皮和骨膜，暴露骨缝。参考脑立体定位图谱[6]确定大鼠PL区和IL区位置：PL组大鼠定位PL区(前囟向前3 mm，中缝旁开0.6 mm，硬膜以下3.6 mm)；IL组大鼠定位IL区(前囟向前3.2 mm，中缝旁开0.6 mm，硬膜以下5.2 mm)。牙科钻于定位点打孔，植入直径0.3 mm的记录电极，头皮下放置参考电极，采用牙科水泥封固，缝合切口。术后单笼饲养，恢复7 d, 青霉素400 kU/kg皮下注射，每日1次，连续5 d。

1.2.2大鼠CPP箱适应性习服CPP视频系统主要通过摄像追踪技术实时记录分析动物在CPP箱内的运动轨迹，进而定量计测动物的行为学指标。本实验CPP箱由等体积的黑箱和白箱组成，两箱之间有可抽动的不透明挡板间隔，当抽出挡板时，动物可在两箱中自由穿梭。建模前抽出挡板，使各组大鼠在CPP箱中适应性习服3 d，每日在箱中自由活动15 min，于第3天观察记录大鼠15 min内在两箱活动时间及运动路程。习服期CPP测试结果表明96%以上的大鼠天然偏爱黑箱，剔除偏爱白箱大鼠。

1.2.3建立吗啡依赖CPP大鼠模型通过制作CPP模型研究动物对成瘾药物的精神依赖性。建模阶段，插入挡板隔开黑、白箱通道，进行CPP训练。实验采用倾向性设计，以非偏爱箱白箱为伴药箱。吗啡PL组和吗啡IL组大鼠每日皮下交替注射吗啡和NS[3,7]，如第1天 8∶00注射吗啡，18∶00注射生理盐水(NS)，第2天 8∶00注射NS，18∶00注射吗啡，以此类推共注射8 d，吗啡注射后大鼠放入白箱45 min，NS注射后放入黑箱45 min。吗啡首日剂量10 mg/kg，第2～6天每日递增10 mg/kg，第6～8天剂量达到并维持60 mg/kg。盐水组同法sc等体积NS。分别在CPP训练结束24 h和72 h后，抽出隔板，任大鼠自由活动15 min，使用视频摄像软件记录大鼠白箱活动时间和白箱运动路程。通过组间比较和组内给药前后比较，以确定大鼠对伴药箱产生CPP。

1.2.4大鼠戒断症状观察建模后停止给药，使大鼠自然戒断24 h～72 h，观察其戒断症状。大鼠戒断症状以改良的柳田知司评分法[8]进行评分：轻微烦躁或间歇咬牙0.5分；碰触激惹、间歇意向震颤、明显烦躁、轻微流涎、连续咬牙各1分；靠近激惹、姿势异常、连续意向震颤、明显流涎各2分；软便或流泪4分；腹泻不成形为8分；体重减少2%～4%为5分，减重4%～6%为10分，减重6%～8%为15分。对每只大鼠的戒断症状各项分值进行总和。

1.2.5mPFC自发脑电的遥测分析打开无线遥测发射子磁控开关，将其固定于大鼠背部，发射子输入端两极分别接记录电极和参考电极，将大鼠投入CPP视频监控箱内，通过发射子实时采集大鼠自发脑电信号，并经智能接收机解码、网络中心机将脑电信号输送至电脑输出脑电图，进一步利用系统软件的快速傅里叶变换功能对原始脑电进行处理分析[9]。采用上述方法记录各组大鼠建模前后、穿梭状态下(黑箱-白箱穿梭、白箱-黑箱穿梭)mPFC脑电活动。

1.3统计学分析

2　结果

2.1吗啡依赖CPP大鼠戒断症状评分情况

建模前，大鼠均无戒断症状(评分为0分)。建模24 h、72 h后，盐水PL和IL组大鼠无戒断症状出现(评分为0分)；吗啡PL和IL组大鼠表现出不同程度的激惹、姿势异常、烦躁、意向震颤、磨牙、流涎、流泪、腹泻等戒断症状。建模24 h、72 h后，吗啡PL组大鼠戒断症状评分(12.5±1.7)分、(15.7±1.4)分，明显高于同时段盐水PL组及建模前(P<0.01)；吗啡IL组大鼠戒断症状评分(14.1±1.6)分、(16.8±1.9)分，明显高于同时段盐水IL组及建模前(P<0.01)。

2.2CPP训练前后大鼠在白箱活动时间和路程变化

建模前各组大鼠在白箱中活动时间和路程无明显差异。建模后24 h、72 h，吗啡PL和IL组大鼠与盐水PL和IL组大鼠及建模前相比，在白箱活动时间及运动路程均明显增加(P<0.05,P<0.01)，且建模后72 h，吗啡PL和IL组大鼠对伴药箱(白箱)表现出更强烈的CPP现象，建模后吗啡PL和IL组大鼠同时段组间比较无明显差异。盐水PL和IL组大鼠组间比较及建模前后比较均无明显差异(表1，表2)。

GroupBeforemodeling24haftermodeling72haftermodelingNSPLcontrol120.3±33.5118.4±28.7131.2±41.7NSILcontrol125.5±37.2129.6±42.4133.7±49.3MorphinePL116.3±25.5230.6±47.8**##365.2±62.7**##MorphineIL124.2±31.4221.8±50.6**##394.4±76.3**##

PL: Prelimbic cortex; IL: Infralimbic cortex

**P<0.01vsbefore modeling;?##P<0.01vsNS control group

GroupBeforemodeling24haftermodeling72haftermodelingNSPLcontrol6.55±4.468.66±4.189.21±3.77NSILcontrol9.47±3.199.16±3.437.47±4.11MorphinePL8.72±2.4016.63±5.95*#18.50±6.00*#MorphineIL7.96±4.1515.96±7.70*#16.46±6.74*#

PL: Prelimbic cortex; IL: Infralimbic cortex

*P<0.05vsbefore modeling;?#P<0.05vsNS control group

2.3大鼠穿梭时mPFC脑电变化

2.3.1大鼠穿梭时PL区脑电变化建模72 h后，吗啡PL组大鼠与盐水PL组相比，向白箱穿梭时，其PL区脑电活动呈现：δ波明显减少(P<0.05)，β波明显增加(P<0.01)，主要为β2波增加(P<0.01)；向黑箱穿梭时，δ波明显增加(P<0.01)，β波明显减少(P<0.01)，β1波和β2波均显著减少。吗啡CPP大鼠穿梭时PL区脑电θ波和α波变化与对照组相比无显著差异(图1)。

2.3.2大鼠穿梭时IL区脑电变化建模72 h后，吗啡IL组大鼠与盐水IL组相比，当吗啡CPP大鼠由黑箱向白箱穿梭时，IL区脑电活动出现：δ波明显增多(P<0.01)，α波明显减少(P<0.05)，主要为α1波减少(P<0.05)，β波明显减少(P<0.01)，β1波及β2波均明显减少(P<0.05,P<0.01)；由白箱向黑箱穿梭时，吗啡CPP大鼠IL区脑电各波与对照组相比均无统计学差异(图2)。

A：From black to white box; B：From white to black box; PL: Prelimbic cortex

*P<0.05,**P<0.01vsPL control group

A: From black to white box; B: From white to black box; IL: Infralimbic cortex

*P<0.05,**P<0.01vsIL control group

2.3.3吗啡CPP大鼠穿梭时PL区与IL区脑电比较建模72 h后，吗啡IL组大鼠与吗啡PL组相比，向白箱穿梭时，吗啡IL组大鼠脑电δ波明显增多(P<0.01)，θ波明显增多(P<0.05)，β波(β1波及β2波)明显减少(P<0.01)；向黑箱穿梭时，吗啡IL组大鼠脑电δ波明显减少(P<0.01)，θ波明显增多(P<0.05)，其余各波与吗啡PL组相比均无明显差异(图3)。

A：From black to white box; B：From white to black box； PL: Prelimbic cortex; IL: Infralimbic cortex

*P<0.05,**P<0.01vsPL morphine group

3　讨论

mPFC在药物依赖形成中的作用正逐渐被研究者认识，国内外有关mPFC的药物依赖研究报道主要集中在mPFC参与的中枢奖赏通路、对成瘾药物的学习、记忆及成瘾药物引起的脑内蛋白表达改变等[10-12]。基于mPFC与伏隔核和中脑腹侧背盖之间存在神经环路[13]，有研究者认为mPFC在阿片药物相关线索与奖赏效应联合的学习过程中起调节作用[14]。如mPFC中PL区的NMDA受体阻断，可影响中脑多巴胺边缘系统的阿片奖赏通路[15], PL区参与的神经环路部分神经元损伤可减少成瘾药物诱导的CPP现象重现[16]，IL区损伤则可能影响成瘾行为的抑制性调控。上述文献表明mPFC在阿片成瘾后的觅药行为改变中起着重要作用。mPFC是形成随意运动意识、动机的主要皮层联络区，阿片成瘾者的mPFC脑电活动不仅反映了皮层神经元对阿片药物的电生理反应特性，也反映了成瘾期的认知活动和觅药动机信息[17]。

本实验主要研究吗啡依赖CPP大鼠穿梭状态下mPFC的遥测脑电变化与觅药行为的关系。通过研究发现吗啡CPP大鼠脑电的特异性变化，可能与吗啡引起的中枢神经系统的适应性改变有关。有文献指出[13]，吗啡使用周期过长会引起mPFC参与的中枢神经环路功能、结构发生可塑性改变，进而使突触传递活动发生变化，通过编码相应的神经元集群发放的突触后电位的总和波，引起PL区和IL区脑电活动的变化。有研究认为[18]PL区神经元有促进觅药功能，阿片药物的长期应用可能使PL区参与的神经环路转变为觅药动机易化区，导致动物觅药行为敏感化，趋向性药物依赖行为增多。研究者对吗啡依赖大鼠穿梭时PL区脑电的小波包提取、功率谱和熵分析显示[19]：当成瘾大鼠向伴药箱穿梭时，PL神经元放电频率增加，EEG平均波幅减小，α波和β波相对功率增加，θ波和δ波相对功率降低，β波小波信息熵增高(熵增高，表明脑电复杂性增高)；向非伴药箱穿梭时，PL脑电表现出相反的改变。另有研究报道[16]，IL区是调控动机、行为的重要脑区之一，IL区中部分神经元具有觅药抑制功能，当IL区神经元选择性失活时，可促进海洛因成瘾大鼠觅药复燃，长期摄入阿片药物能够使IL区部分神经元功能、结构受损，导致成瘾者对觅药渴求、用药行为的控制能力下降[20]。本研究与上述文献报道的实验结果均表明：吗啡CPP大鼠在向白箱穿梭时，受到白箱等伴药线索的刺激，PL的觅药动机易化区神经元被激活，兴奋性增高，其脑电活动呈高频去同步化快波增多趋势，脑电复杂度增高，精神行为学方面表现出觅药探究意识增强；IL区的部分皮层神经元活动被抑制，兴奋性降低，其脑电呈同步化慢波增多改变。吗啡CPP大鼠在向黑箱穿梭时，非伴药线索黑箱，可抑制PL区神经环路的兴奋输入，使其神经元兴奋性降低，PL脑电活动呈同步化慢波增多，脑电相似性增高(熵值低)，精神行为学方面表现出相对安静，觅药探究意识减弱；IL区脑电活动在大鼠向黑箱穿梭时，与对照组相比，无显著差异。进一步比较吗啡IL组和吗啡PL组大鼠脑电结果，发现吗啡CPP大鼠向白箱穿梭时，IL区脑电慢波(δ波和θ波)比PL区明显增多， 快波β波明显减少，与前述结果分析相一致；当大鼠向黑箱穿梭时，IL区脑电与PL区相比，δ慢波明显减少，而θ慢波明显增多，为何在两种穿梭状态下IL脑电θ波均比PL区增多？比较盐水PL组和盐水IL组大鼠脑电发现，正常大鼠IL区脑电θ波比PL区增多，由此判断θ波增多可能与戒断期吗啡CPP大鼠的觅药动机改变无关。

综上，吗啡CPP大鼠穿梭状态下mPFC的EEG结果表明，PL区和IL区在成瘾过程中的作用不同。因此在同一穿梭状态下其脑电改变不同，同时大鼠向伴药箱穿梭与非伴药箱穿梭发生的脑电变化也不同，可能不同觅药环境线索在mPFC不同脑区产生的脑电改变存在不同机制。

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EEG characteristics of medial prefrontal cortex in rats with morphine dependent place preference under shuttling condition

LI Jing, PAN Qun-wan△, ZHU Zai-man, LI Min, YE Zheng

(Department of Physiology, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)

Objective: To study the correlation between EEG characteristics of medial prefrontal cortex (mPFC) and drug-seeking behavior of rats with morphine dependent place preference under shuttling condition. Methods: Forty rats were randomly divided into four groups (n=10): morphine PL group, NS PL group, morphine IL group and NS IL group. After embeding the electrode in prelimbic (PL) or infralimbic (IL) cortex of each group by brain stereotaxic operation, the model of morphine dependent conditioned place preference (CPP) in rats was established. The differences of EEG wave percentage in mPFC were telemetered and analyzed when rats shuttled before and after the model. Results: After the model, the withdrawal symptoms were evident in morphine PL and IL group, and the activity time and distance in white box were increased obviously. Compared with control group, after the model, the EEG in morphine PL group showed that: when the rats shuttled to white box, δ wave decreased obviously, β wave increased obviously. When the rats shuttled to black box, brain waves showed opposite changes. The EEG in morphine IL group showed that: when the rats shuttled to white box, δ wave increased obviously, β and α wave decreased obviously. When the rats shuttled to black box, the brain wave had no significant differences compared with control group. Conclusion: The EEG changes are different in PL and IL cortex of morphine CPP rats under shuttling condition, and the EEG changes are also different when rats shuttling to white or black box. There is possibly different mechanism, when different drug-seeking environmental cues caused EEG changes in different regions of mPFC.

morphine dependence;conditioned place preference (CPP);medial prefrontal cortex (mPFC);EEG;telemetry;rat

安徽省高校自然科学研究重点资助项目(KJ2015A193)；安徽省自然科学基金资助项目(090413096)；皖南医学院中青年科研基金资助项目(WK201406)

2015-02-25

2015-10-08

△Tel：0553-3932473； E-mail：panqunw@163.com，muzisanri520@163.com

R338.8

A

1000-6834(2016)01-092-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.024