力竭运动后不同时相大鼠心肌p-p38MAPK、NF-kB、COX-2表达的动态变化*

郑妩媚， 初海平， 王　燕， 王福文△

(1. 山东省医学科学院药物研究所， 2. 济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院， 济南 250062)



力竭运动后不同时相大鼠心肌p-p38MAPK、NF-kB、COX-2表达的动态变化*

郑妩媚1,2， 初海平1， 王燕1， 王福文1△

(1. 山东省医学科学院药物研究所， 2. 济南大学 山东省医学科学院医学与生命科学学院， 济南 250062)

目的：观察急性力竭运动后不同时相大鼠心肌组织p38丝裂原蛋白激酶(p38MAPK)的磷酸化程度、核因子 (NF-kB)和环氧合酶-2(COX-2) 的动态变化，探讨其对力竭性运动损伤心肌组织的作用。方法：雄性Wistar大鼠60只随机分为对照组和力竭运动组，力竭运动组再分为运动后0 h组、3 h组、6 h组、12 h组、24 h组5个亚组(n=10)。通过一次性力竭游泳运动建立心肌损伤模型，分别于运动结束后不同时间点取大鼠左心室心肌组织，Western blot法检测p-p38MAPK、NF-kB、COX-2蛋白表达。结果：与对照组相比，力竭运动后不同时间点大鼠心肌组织中p-p38MAPK均显著增加(P<0.01)，且3 h组最高(P<0.01)； 运动后0 h，大鼠心肌组织中NF-kB和COX-2含量均无明显改变，其余时间点二者均明显增加(P<0.05)，NF-kB 含量6 h组显著高于其它各组(P<0.05)，COX-2含量24 h组显著高于其它各组(P<0.05)。结论：一次性急性力竭运动可以激活p38MAPK信号通路，从而活化NF-kB，并上调COX-2表达，引发过度炎症反应，提示p-p38MAPK、NF-kB和COX-2在急性力竭运动诱发心肌损伤的过程中可能起着重要作用。

力竭运动；p-p38MAPK；NF-kB；COX-2；大鼠；心肌细胞

随着竞技体育比赛的日益激烈，过度运动所致的运动性心肌损伤的发生日益显著，正成为运动医学领域十分关注的严重问题之一。其病理发生机制极其复杂，涉及众多因素，但过度的炎性反应是其产生的重要机制之一。环氧化酶-2(cycloxygenase-2,COX-2)又称为炎症诱导酶，是影响体内花生四烯酸代谢中最主要的前列腺素合成限速酶。文献报道通过降低COX-2 mRNA表达，能减少患心血管疾病的风险[1]。新型的COX-2抑制剂莫比可高选择性的抑制COX-2，能很好地减缓急性运动创伤性炎症[2]。p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKS)是生物体内重要的信号传导系统之一，在机体应激和炎症反应中起着非常重要的调节和控治的作用。核因子-kB(nuclear factor kappa B, NF-kB)是在心肌细胞、血管内皮细胞等细胞内广泛存在，活化的NF-kB可以调节多种炎症相关因子如趋化因子、细胞粘附分子、细胞因子等基因的转录。 目前，关于力竭性运动诱发心肌损伤过程中p-p38MAPK、NF-kB和COX-2的动态研究少见报道。本实验通过大鼠负重力竭游泳运动建立心肌损伤动物模型，观察大鼠一次性力竭运动后不同时相p-p38MAPK、NF-kB、COX-2表达的动态改变，并探讨它们在运动性心肌损伤产生中的作用。

1　材料与方法

1.1主要试剂与仪器

p-p38MAPK兔单克隆抗体(美国Cell Signaling, #4511)，NF-kB兔单克隆抗体(美国Cell Signaling, #8242)，COX-2兔单克隆抗体(美国Cell Signaling, #12282)。J-25型高速冷冻离心机，美国 BLCKMEN公司；Victor1420多功能标记仪，美国PERKIN ELMER公司；DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；LAS4000型化学发光成像仪，日本FUJIFLM公司。

1.2实验动物

健康雄性Wistar大鼠60只，体重220～250 g，SPF级，购买于山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(鲁)20130001。实验期间，实验动物饲养在屏障环境，分笼饲养，每笼5只，室温维持在20℃～26℃，保持相对湿度40%～70%，自由饮水。动物室安静、通风。实验动物饲料由山东省实验动物中心提供，由济南康大饲料有限公司生产，许可证号：SCXK(鲁)20130017。

1.3运动性心肌损伤实验动物模型建立

按照王福文等[3]的方法、条件和标准建立一次性大鼠力竭模型。大鼠尾部负2%体重的负荷进行力竭游泳，游泳时间不能少于3 h。

1.4实验分组

健康雄性Wistar大鼠60只，适应性喂养5 d，根据体重随机分为安静对照组和力竭运动组，后者又分为力竭运动后0 h组、3 h组、6 h组、12 h组、24 h组(n=10)。安静对照组大鼠不做任何运动，力竭性运动组按照建模要求运动。

1.5动物取材

大鼠运动结束后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h，分别腹腔注射20%乌拉坦(0.2 ml/100 g)麻醉，放血后迅速取下心脏，在左心室同一部位取心肌组织200～250 mg，装入EP管中，置于-80℃冰柜中保存备用。

1.5.1Western blot法检测心肌组织中p-p38MAPK、NF-kB、COX-2 的表达取液氮保存的心脏组织100 mg，在研钵中加入液氮研磨，然后加入含1 mmol/L PMSF的裂解液1 ml研磨均匀，倒入玻璃匀浆器中充分裂解，设置高速低温离心机的条件为14 000 r/min、4℃，离心10 min，取上清液，分装，-80℃保存备用。BCA试剂盒测定匀浆上清液的蛋白浓度，按常规方法进行SDS-PAGE电泳，10%分离胶，5%浓缩胶，p-p38 一抗(1∶1 000)、NF-kB(p50)一抗(1∶1 000)和COX-2 一抗(1∶500)，化学发光成像仪进行显影后，应用Image J图像处理系统处理蛋白条带，进行半定量分析。

1.6统计学分析

2　结果

2.1各组心肌组织中p-p38MAPK表达

与安静对照组比较，大鼠力竭运动后不同时间0 h组、3 h组、6 h组、12 h组、24 h组 心肌组织中p-p38MAPK蛋白表达均显著升高(P<0.05)，且3 h组最高，随后明显降低(P<0.01，图1, 表1)。

Tab. 1　Effect of acute exhausted exercise on p-p38MAPK, NF-kB and COX-2 in rats-relative ±s， n=10)

p-p38MAPK：p-p38 mitogen-activated protein kinase； NF-kB：Nuclear factor kappa B; COX-2: Cycloxygenase-2

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;?#P<0.05,##P<0.01vs0 h group;?△P<0.05,△△P<0.01vs3 h group;?▲P<0.05,▲▲P<0.01vs6 h group;?○P<0.05vs12 h group

Fig. 1Dynamic change of myocardium p-p38MAPK in different time periods after single bout exhausted exercise in rats

2.2心肌组织中NF-kB表达

与安静对照组比较，力竭运动组大鼠运动后3 h组、6 h组、12 h组和24 h组 心肌组织中NF-kB蛋白表达均显著升高(P<0.05，P<0.01)；运动后0 h组、3 h组和6 h 组NF-kB表达逐次递增，且6 h组为最高(P<0.01)，随后逐渐降低(P<0.01,表1, 图2)

2.3心肌组织中COX-2表达

与安静对照组比较，力竭运动组大鼠运动后3 h组、6 h组、12 h组和24 h 组心肌组织中COX-2蛋白表达均显著升高(P<0.05，P<0.01)，运动后0 h组、3 h组、6 h组 COX-2蛋白表达逐次递增， 6 h组显著高于运动后0 h组和 3 h组(P<0.05)，12 h组有所降低， 24 h组达高峰(P<0.05，P<0.01，表1，图2)

Fig. 2Dynamic change of myocardium NF-kB and COX-2 in different time periods after single bout exhausted exercise in rats

NF-kB：Nuclear factor kappa B; COX-2: Cycloxygenase-2

3　讨论

适度运动可以有效地改善心血管功能，而过度运动作为一种应激性刺激，会导致心脏功能不全、超微结构损伤、电生理异常等。因此由过度运动尤其是力竭运动或长时间的剧烈运动所引起的心肌损害逐渐成为运动医学领域的热点问题之一。有研究表明，大鼠力竭运动中由于心肌缺血缺氧可致心肌产生一定的损伤，随后由于血液供应的恢复，可致心肌产生比运动时更严重的损伤，这与临床缺血再灌注损伤相似，因此又称之为运动性缺血再灌注损伤[4]。王福文等[3]研究表明，力竭性运动不仅可以产生直接的心肌损伤，也可以引起运动延迟性心肌损伤。

众所周知，炎症是由炎症介质如花生四烯酸等引起的，机体受到局部损伤或刺激后，在环氧合酶作用下花生四烯酸转化为前列腺素，引起炎症。COX又名前列腺素内过氧化物合成酶，有COX-1和COX-2两种亚型，结构酶COX-1在正常生理状态下持续表达，对炎症介质的增加没有影响；COX-2为诱生性酶，其表达受细胞内外各种刺激因素调节，与炎症、疼痛等有密切关系，可通过催化花生四烯酸促进炎性前列腺素物质合成，引起炎症反应和介导炎性细胞毒性。抑制COX-2表达，可减轻心肌炎症反应，减轻心肌缺血再灌注损伤[5]。

COX-2的表达受多个程序调控，其一可通过p38MAPK信号通路上调COX-2的表达。p38MAPK信号转导通路是最近研究较多的一种调控炎症机制的信号通路，磷酸化的p38MAPK是p38MAPK信号通路中介导炎性反应的活性物质。研究已证实，p38MAPK抑制剂SB203580可明显降低炎症因子的产生，从而减少炎症反应[6]。COX-2启动子的活性可通过p38MAPK特异性抑制剂显著下调[7]。本实验结果表明，力竭性运动后不同时间心肌组织中p-p38MAPK表达均显著增加，且3 h p38MAPK磷酸化程度最高，说明力竭性运动可以激活起p38MAPK信号通路。其二是通过NF-kB信号通路对COX-2起调控作用。NF-kB是对缺氧敏感的炎症反应标志物，它可以调节超过60个基因的转录表达如细胞粘附分子、细胞因子、化学趋化因子等，参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡等多种生物学过程。

临床研究表明，NF-kB在心肌缺血再灌注损伤中起着重要作用，NF-kB p65可诱导COX-2表达，诱导和增强炎症反应，在心肌缺血再灌注过程中发挥重要作用[8]。p38MAPK信号通路和NF-kB信号通路具有相关性，活化的p38MAPK进入细胞核，激活NF-kB，下调p38MAPK信号通路可抑制NF-kB的过度激活[9]。p38MAPK在调节激活子蛋白-1(transcription activitor 1，AP-1)的活性中起着重要作用，而AP-1是调节COX-2表达的重要转录因子，抑制NF-kB和AP-1的活性可以控制COX-2的表达[10]。本实验结果表明，力竭性运动后3 h p38MAPK磷酸化程度最高，6 h NF-kB达到高峰，滞后于p38MAPK的表达，24 h COX-2达到高峰，滞后于p38MAPK、NF-kB的表达，p38MAPK、NF-kB与COX-2在表达强度上有时相上的先后性。p38MAPK通路可以通过多种间接方式调节NF-kB的活化，p38MAPK和NF-kB可能共同参与了COX-2的发生、发展过程。说明在力竭运动诱发心肌损伤的过程中，过度运动可能首先激活p38MAPK信号通路，使p38MAPK磷酸化，然后活化NF-kB，从而调控且促进COX-2的表达，引发过度炎性反应，造成运动性心肌损伤。因此p38MAPK可能是预防和治疗运动性心肌损伤的新靶点。有研究发现，给予p38MAPK特异性抑制剂BIRB796后，p38MAPK表达明显下降，心肌缺血再灌注损伤明显减轻[11]。刘流[12]等人也发现，p38MAPK的表达能减少炎性因子生成，抑制炎性反应，从而减少心肌缺血再灌注损伤。

总之，一次性力竭运动可以引起心肌p-p38MAPK、NF-kB、COX-2均出现不同程度的升高，且高峰期呈时间依赖式特点，提示p38MAPK信号通路、NF-kB 和COX-2皆介入了运动性心肌损伤的形成过程。

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The dynamic expression changes of myocardium p-p38MAPK, NF-kB and COX-2 in rats after an exhausted exercise

ZHENG Wu-mei1,2, CHU Hai-ping1, WANG Yan1, WANG Fu-wen1△

(1. Institute of Materia Medica, Shandong Academy of Medical Sciences, 2. School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan- Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China)

Objective: To observe the dynamic expression changes of p38 mitogen-activated protein kinase(p38MAPK), nucler facter kappa B (NF-κB) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in myocardial tissue after an exhausted exercise and study the impact of p38MAPK, NF-kB and COX-2 on its myocardial damage. Methods: Sixty Wister male rats were randomly divided into the control group (n=10) and the exhausted exercise group (n=50). Then the exhausted exercise group was further divided into 5 subgroups, namely 0 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h after an exhausted exercise(n=10). The myocardial injury animal model was set up by using an exhausted swimming exercise and the expression of p-p38MAPK, NF-kB and COX-2 were examined by Western blot. Results: Compared with the control group, the expression of p-p38MAPK were increased significantly(P<0.01) in all the groups and the 3 h group was the highest(P<0.01); The expression of NF-kB were increased significantly(P<0.05) in all the groups but 0 h (P>0.05) and the 6h group was increased significantly compared with the other groups(P<0.05); The expression of COX-2 were increased significantly(P<0.05) in all the groups but 0 h and the 24 h groups was increased significantly compared with the other groups(P<0.05). Conclusion: p38MAPK was activated in an acute exhausted exercise, p-p38MAPK may play an important role in modulating NF-kB and COX-2 expression and mediating the exhausted exercise induced myocardial damage.

exhaustive exercise;p-p38MAPK;NF-kB;COX-2;rats;myocardial cell

国家科技重大专项子课题(2009ZX09301-013)；山东省自然科学基金项目资助(ZR2009CM089)

2015-06-15

2015-10-12

△Tel: 0531-82919972； E-mail: wangfuwww@tom.com

R965.2

A

1000-6834(2016)01-088-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.023