雷帕霉素对淀粉样β蛋白所致大鼠工作记忆和突触可塑性损伤的作用观察*

郝　明， 仝嘉庆， 张　军， 武美娜， 祁金顺

(山西医科大学生理学系， 细胞生理学省部共建教育部重点实验室， 太原 030001)



雷帕霉素对淀粉样β蛋白所致大鼠工作记忆和突触可塑性损伤的作用观察*

郝明， 仝嘉庆， 张军， 武美娜， 祁金顺△

(山西医科大学生理学系， 细胞生理学省部共建教育部重点实验室， 太原 030001)

目的：观察雷帕霉素对淀粉样β蛋白(Aβ1-42)所致大鼠工作记忆和突触可塑性损伤的影响。方法：SD大鼠(n=44)双侧海马注射Aβ1-42建立AD模型，雷帕霉素预处理后，进行Y-迷宫行为学实验和在体海马场电位实验，分别记录大鼠在Y-迷宫中的正确交替反应率和海马长时程增强(LTP)。结果：①与对照组相比，海马单独注射Aβ1-42可导致大鼠Y迷宫试验中工作记忆明显下降；②单独注射雷帕霉素不影响大鼠的工作记忆，但雷帕霉素预处理可有效逆转Aβ1-42引起的工作记忆损伤；③单独注射Aβ1-42明显压抑了大鼠在体海马CA1区突触传递的LTP效应；④雷帕霉素预处理有效逆转了Aβ1-42引起的LTP压抑。结论：雷帕霉素可有效拮抗Aβ1-42所致的大鼠工作记忆和突触可塑性损害，提示其具有一定的神经保护作用。

雷帕霉素；淀粉样β蛋白；工作记忆；海马长时程增强；阿尔茨海默病；大鼠

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种中枢神经系统原发性退行性疾病，主要表现为认知功能下降、精神行为异常和生活能力下降，晚期出现严重痴呆。AD主要的病理改变是脑内细胞外出现高密度的老年斑、细胞内Tau 蛋白过度磷酸化形成神经原纤维缠结(NFTs)以及大量神经元丢失。β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)是老年斑的主要成

分，是淀粉样前体蛋白(amyloid β precursor protein，APP) 在γ和β分泌酶的作用下裂解而成的一个多肽，具有广泛的神经毒性。研究证实，Aβ水平受生成率和清除率的共同影响。在自噬失调的细胞中，γ分泌酶活性增强；AD病人早期脑内Beclin1蛋白表达减少，自噬体成熟过程受阻，自噬减弱，导致Aβ水平增加和老年斑的形成。因此，自噬失调在AD的发病过程中可能起着重要的作用。

雷帕霉素属大环内酯类抗生素，与他克莫司(FK506)结构相似，1999年9月由美国FDA认证作为肾移植的免疫抑制药物投放市场。哺乳动物细胞的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种保守的丝-苏氨酸蛋白激酶，在多条信号途径中发挥着中心传感器的效应。mTOR包括mTORC1和mTORC2两个不同的复合体。其中，mTORC1由raptor和GβL两个蛋白协助，将整合的信息传递给下游的两个关键的效应分子：S6激酶-1(S6K1)和起始因子4E结合蛋白-1(4E-BP1)。雷帕霉素则通过干扰raptor识别S6K1，从而抑制S6K1磷酸化，导致自噬的发生。而mTORC2对雷帕霉素不是很敏感。目前发现仅mTORC1/ S6K1对营养代谢敏感，mTORC1在自噬调控中发挥主要作用[1]。最近报道，P301S小鼠经过长期或短期的雷帕霉素治疗后神经原纤维缠结病理性改变明显减少，星形胶质细胞增生减少，主要机制是雷帕霉素通过提高自噬水平，清除Aβ和异常磷酸化的Tau 蛋白[2]，从而减少炎症反应，发挥神经保护作用。然而雷帕霉素在行为学上是否能拮抗Aβ对大鼠工作记忆的影响仍缺乏实验证据，在反映学习记忆机制的突触传递可塑性上是否能保护海马长时程增强(long-term potentiation, LTP)免受Aβ的伤害仍未见报道。本研究在海马局部注射 Aβ1-42寡聚体建立AD动物模型基础上，应用Y-迷宫自发性交替实验和在体海马场电位记录手段，观察了雷帕霉素预处理对大鼠工作记忆和LTP的神经作用,为AD的发病机制及其防治提供依据。

1　材料与方法

1.1实验动物及海马注射

实验动物为清洁级成年雄性SD 大鼠，体重 200～230 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。大鼠的饲养环境为：12 h/12 h明暗交替、湿度为50%～60%、室温为 22℃～25℃，自由饮食。将44只大鼠随机分为4组(n=11)：vehicle+PBS、vehicle +雷帕霉素(2 μmol)、Aβ1-42 (5 μg)+PBS和Aβ1-42+雷帕霉素。其中，vehicle为生理盐水，Aβ1-42 (Abcam , USA) 和雷帕霉素 (cell signaling Technology, USA)经微量二甲基亚砜 (DMSO) 充分溶解后，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)稀释，浓度分别为2.5 μg/μl和1 μmol/μl。Aβ1-42在37℃下孵育36 h，间断振荡，使其老化成寡聚体。DMSO 终浓度小于0.1%，为生理无效范围[3, 4]。在水合氯醛 (0.3 g/kg) 麻醉下，将SD 大鼠固定于脑立体定位仪 (RWD68004, RWD Life Science, China) 上。切开头皮，以前囟点 (Bregma) 为基准，参照大鼠脑立体定位图谱，用骨钻钻孔，而后用石英毛细给药管插入双侧海马CA1 区 (Bregma后3.0 mm，中线旁开2.2 mm，深度3.0 mm)，再使用微量注射泵 (KDS 310 Plus, KDS scientific, USA) 将药物或溶剂 (2 μl)缓慢注入双侧海马，给药速度0.2 μl/min。药物注射完后保留给药管10 min，然后退出给药管，用骨蜡封闭创口，缝合皮肤，动物恢复12 d。

1.2Y-迷宫实验

动物术后12 d进行Y-迷宫实验，为期1 d。Y-迷宫实验的实验装置由三个夹角为120°的支臂组成，分别称为A、B、C臂。实验时将大鼠放在三个臂的交汇点，让其自由出入三个臂，记录8 min内每只大鼠进入三个臂的总次数和顺序，以连续进入三个不同的臂为一次正确交替反应，记录正确交替反应次数。用正确交替反应率反映大鼠的工作记忆能力。正确交替反应率=正确交替次数/(进臂总次数-2)×100%。

1.3在体海马场电位记录

行为学实验后，将大鼠经腹腔注射乌拉坦(sigma-Aldrich, UK, 1.5 g/kg)麻醉，并固定在脑立体定位仪上。切开头皮，以前囟点为基准，参照大鼠脑立体定位图谱，使用骨钻钻孔，将绑定的刺激和记录电极(Sequim, WA, USA)插入到大鼠海马CA1区，记录场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)。刺激电极尖端位于海马Schaffer 侧支/连合通路(Bregma后4.2 mm, 中线旁开3.8 mm)，记录电极尖端位于海马CA1区的放射层(Bregma后3.8 mm, 中线旁开2.5 mm)。先使用电刺激器(Master-9 Pulse Stimulator, AMPI, Israel)给予海马Schaffer侧支重复的单个测试刺激，稳定30 min左右，记录30 min基础性fEPSP，而后记录双脉冲易化(paired pulse facilitation, PPF)。然后用引起最大fEPSP幅值30%～50%的刺激强度给予高频刺激(HFS)，诱发LTP，随后改为单个测试刺激记录1 h fEPSP。

1.4数据分析

2　结果

2.1雷帕霉素保护大鼠工作记忆免受Aβ1-42引起的损伤

Y-迷宫中自发交替反应率可以反映工作记忆，是一种测试动物学习记忆有效而客观的方法。vehicle+PBS、vehicle +雷帕霉素、Aβ1-42+PBS和Aβ1-42+雷帕霉素大鼠在8 min 的自发交替实验中进入Y迷宫3个臂的总次数(21.33±2.69、19.83±2.48、20.67±2.43、21.83±2.54)之间无明显统计学差异(图1A)，表明药物的给予并没有影响动物的运动功能。然而，双侧海马注射Aβ1-42的大鼠在Y迷宫自发交替实验中的正确交替反应率(59.57±6.21)%较正常对照组(77.29±2.09)%显著降低(P<0.01)，表明Aβ1-42可显著损伤大鼠的工作记忆；单独给予雷帕霉素(76.27±4.58)%对大鼠的工作记忆没有影响，与对照组相比无统计学差异；但在联合给予Aβ1-42组(77.60±5.30)%中，雷帕霉素显著拮抗了Aβ1-42对工作记忆的损伤，自发性交替反应正确率较单独给予Aβ1-42组明显增加 (P<0.01，图1B)。

A：No significant difference in the total number of arm entries in all groups; B：Lower spontaneous alternation of rats after injection of Aβ1-42 alone and a significant recovery in Aβ1-42+rapamycin group

**P<0.01vsPBS+vehicle;?##P<0.01vsPBS+Aβ1-42

2.2雷帕霉素保护大鼠在体海马LTP免受Aβ1-42引起的影响

行为学实验结束后第2天，对同批大鼠进行在体海马场电位fEPSP记录实验，观察双侧海马内注射Aβ1-42、雷帕霉素及二者联合应用对大鼠在体海马fEPSP的LTP的影响。如图2A和图2B所示，双侧海马注射Aβ1-42不影响CA1区的基础性突触传递，但明显抑制了HFS引起的LTP，fEPSP的平均斜率在HFS后1h末为(114.72±2.54)%，明显低于对照组的(134.00±0.79)% (P<0.01)，表明Aβ1-42显著抑制了海马CA1区的LTP维持。单独给予雷帕霉素对基础fEPSP的斜率和HFS后引起的LTP均没有影响，与对照组相比，无明显统计学差异；但雷帕霉素可以显著拮抗Aβ1-42对LTP的压抑作用，HFS后1 h末fEPSP的平均斜率保持在(133.72±1.71)%，明显高于单独给予Aβ1-42组的(114.72±2.54)% (P<0.01)。图2C显示了各组在HFS前与HFS后1 h典型的fEPSP曲线。

2.3雷帕霉素和Aβ1-42不影响海马CA1区双脉冲易化

为探究雷帕霉素和Aβ1-42在LTP实验中是否有突触前机制的参与，我们进一步记录了海马CA1区的PPF。结果如图2D所示，给予Schaffer侧支两个间隔为50 ms的双脉冲刺激后，能可靠诱发和记录CA1区的PPF(各组PPF百分为vehicle+PBS：(183.67±1.83)%、vehicle +雷帕霉素：(180.10±2.74)%、Aβ1-42+PBS：(180.94±1.24)%和Aβ1-42+雷帕霉：(185.51%±3.00)%，均没有显著差异。这提示两种药物对突触前神经递质的释放均不构成明显影响。

A and B: Aβ1-42 remarkably suppressed in vivo LTP of fEPSPs in the CA1 region ; C: Typical fEPSP traces in different groups indicated in Fig3A before and after HFS; D: Effects of Aβ1-42 and rapamycin on hippocampal PPF

**P<0.01vsPBS+vehicle;?##P<0.01vsPBS+Aβ1-42

3　讨论

AD是一种渐进性的神经退行性疾病[5]。AD患者有渐进性认知功能障碍，精神症状和行为紊乱。AD的主要病理表现是脑内出现高密度的淀粉样斑块、神经原纤维缠结、神经元的缺失和脑萎缩。其中淀粉样斑块和神经原纤维缠结可以引发各种免疫炎症反应和神经毒性反应，引起广泛的神经元变性，甚至死亡[6]。神经元变性主要发生在海马和大脑皮层，可引起记忆和认知功能障碍，最终导致痴呆的发生。

动物学习记忆功能可以通过行为学实验进行评价，如Morris水迷宫、T迷宫、Y-迷宫以及八臂迷宫实验等。本研究应用Y-迷宫自发交替实验，该方法通过测定大小鼠工作记忆，可用来评价痴呆动物模型成功与否，因而为国内外研究人员在测试动物学习记忆行为时广泛使用。工作记忆是一种特殊的短时性记忆，具有短时存储、实时刷新和容量有限的特点，也是AD患者早期即出现的常见的认知功能障碍。前额叶是工作记忆的关键脑区，海马也在工作记忆中起重要作用。同时，海马还参与短期记忆向长期记忆的转移；海马的LTP也被认为是认知记忆的主要细胞机制之一。LTP是神经元之间的化学性突触传递功能发生的长时程增强现象，其不仅为研究高等动物脑内活动的突触可塑性提供了有力证据，而且为研究学习记忆的突触可塑性机制提供了一个理想的模型。因此，本研究采用大鼠双侧海马注射Aβ1-42建立AD模型，同时观测了大鼠的工作记忆行为学变化和海马LTP电生理改变。我们的行为学实验结果证明：海马注射Aβ1-42可引起大鼠工作记忆功能的下降；电生理实验则显示：海马注射Aβ1-42可引起LTP压抑。这些结果表明该模型是有效的。重要的是，本研究不仅观察到海马注射Aβ1-42可以伤害正常大鼠的工作记忆和海马突触可塑性，而且发现雷帕霉素能够逆转Aβ1-42所致的大鼠Y迷宫自发性交替行为和海马LTP的损伤。这一结果表明，雷帕霉素能够拮抗Aβ1-42的神经毒性，保护大鼠认知行为和突触可塑性免受Aβ1-42的伤害，提示雷帕霉素对实验性AD具有一定的防治作用。同时，雷帕霉素保护认知行为可能与维持海马正常的突触可塑性特别是突触后机制有关，因为实验中能够反映突触前神经递质释放的PPF没有发生明显变化。

有证据表明，雷帕霉素的神经保护机制可能是通过增强细胞的自噬活动引起的[7]。雷帕霉素可以抑制mTOR，提高自噬水平，通过增强自噬吞噬清除Aβ和吞噬异常磷酸化的Tau蛋白[8]，起到神经保护和改善AD认知功能的作用[9]。自噬不仅参与了Aβ的生成和清除过程，而且还参与了Tau蛋白的代谢过程。看来，自噬的损伤与失平衡是Aβ在脑内聚集、Tau蛋白发生过度磷酸化乃至AD 最终发生的一个重要的早期因素。AD动物模型和AD病人自噬溶酶体功能受损，提示恢复自噬溶酶体正常功能是治疗AD[10]的一种潜在途径。本研究证实的雷帕霉素拮抗Aβ神经毒性作用是否也与保护自噬溶酶体功能有关尚待证实。但不容置疑的是，雷帕霉素已经在治疗神经退行性疾病如AD、帕金森病和亨廷顿氏病乃至延长寿命、延缓衰老中显示出良好的神经保护作用和令人欣慰的实验效果。尽管目前已有不少研究在揭示自噬与AD之间的关系，但这一研究领域仍有许多未知因素，针对自噬途径开发靶向预防和治疗AD药物的前景仍然令人期待。

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Effects of rapamycin on amyloid β-protein induced impairments of working memory and synaptic plasticity in rats

HAO Ming, TONG Jia-qing, ZHANG Jun, WU Mei-na, QI Jin-shun△

(Department of Physiology, Shanxi Medical University, Key Laboratory for Cellular Physiology of Ministry of Education Functional Center of Medical Experiment, Taiyuan 030001, China)

Objective: The present study investigated the effects of rapamycin on Aβ1-42-induced deficits in working memory and synaptic plasticity. Methods: After bilateral hippocampal injection of Aβ1-42 and rapamycinin rats，spontaneous alternationin Y-maze and in vivo hippocampal long-term potentiation (LTP) of rats were recorded. All data were analized by two-way repeated measures analysis of variance (ANOVA). Results: ①Hippocampal injection of Aβ1-42 alone impaired working memory of rats; ②Rapamycin did not affect working memory of rats, but alleviated Aβ1-42-induced working memory deficits, compared with Aβ1-42 alone group; ③Aβ1-42 remarkably suppressed in vivo hippocampal LTP of fEPSPs in the CA1 region; ④Pretreatment with rapamycin prevented Aβ1-42-induced suppression of LTP. Conclusion: These data indicates that rapamycin could protect against Aβ1-42-induced impairments in working memory and synaptic plasticity in rats.

rapamycin；amyloid β protein;working memory；hippocampal long-term potentiation；Alzheimer’s disease；rat

国家自然科学基金(31471080，31271201，31300968)；山西省回国留学人员科研资助项目(2013-054)；山西医科大学科技创新基金(01201105)

2015-03-23

2015-09-18

△Tel：13513604379； E-mail：jinshunqi2009@163.com

R338

A

1000-6834(2016)01-018-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.005